本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种邻苯二酚2,3‑双加氧酶基因及其应用。所述的邻苯二酚2,3‑双加氧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因表达的产物邻苯二酚2,3‑双加氧酶，能高效的水解芳香族化合物邻苯二酚、4‑甲基邻苯二酚、对苯二酚、1,2,4‑苯三酚和2,6‑二甲基‑1,3,4‑苯三酚等。可用于环境污染的生物修复，工业废水处理以及2‑羟基粘糠酸半醛的生产等行业，不仅可以解决邻苯二酚等芳香族化合物的环境污染问题，还可以取得可观的经济效益。
【技术实现步骤摘要】
一种邻苯二酚2,3-双加氧酶基因及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种邻苯二酚2,3-双加氧酶基因及其应用。
技术介绍
邻苯二酚2,3-双加氧酶也叫变儿茶酚酶(MPC)，存在于很多降解芳香族化合物的细菌中，它能催化苯环的邻位裂解，将无色或微棕色的邻苯二酚转变成黄色的2-羟基粘糠酸半醛。不同细菌产生的C23O在理化性质、催化活性、酶作用底物等方面都有不同程度的差别，编码C23O的基因也因细菌种类而不同。寻找不同细菌来源的C23O基因及表达产物，对于解决不同环境条件以及不同种类的芳香族化合物造成的环境污染问题具有重要意义。菌株Sphingbiumsp.MEA3-1可以高效降解包括2,6-甲乙基苯胺在内的一些芳香族化合物(该菌株于2012年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，编号为CCTCCNo.M2012527)。根据Sphingbium属细菌基因组信息分析认为，菌株MEA3-1对一些芳香族化合物的降解是通过其分泌的邻苯二酚2,3-双加氧酶使芳香环开环实现的。近年来，随着分子生物学技术的发展，虽然已有很多关于邻苯二酚2,3-双加氧酶基因表达方面的研究，但这些邻苯二酚2,3-双加氧酶的酶活往往比较低，并且催化反应所需的温度比较高，不适合在低温条件下使用，因此非常有必要构建低温高效的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因工程菌株。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种邻苯二酚2,3-双加氧酶基因。本专利技术的另一目的在于提供上述邻苯二酚2,3-双加氧酶基因的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种重组载体，该重组载体包含上述邻苯二酚2,3-双加氧酶基因的核苷酸序列。本专利技术的第四个目的在于提供一种转邻苯二酚2,3-双加氧酶基因的工程菌。本专利技术第五目的在于提供一种重组邻苯二酚2,3-双加氧酶，该重组邻苯二酚2,3-双加氧酶由上述工程菌诱导表达、纯化、复性得到。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种邻苯二酚2,3-双加氧酶基因，其核苷酸序列如下所示：ATGGCGATTCGTGGATTGCTCCGGGTCGGCGAAGTGTGCGTCAGGGTGTTCGACATCGACGACGCGCGCCGCCACTATGGCGAGCGGATGGGTCTTATCGAAACCTATCAGGGCGACCCCGACAAGCTCTATTACAAGGTCGCGGACGAGCATGACTGGTATTCGCTGGTCCTGCAGAAGGCCGATGCGCCCGGCGTCGAATATTTCGCCTTCCGCACCTATGAGGATGCGGAGATCGACCATTTCGCCGCGGCGCTGACCGAATATGGCCTTGCCGTCGAACATGTCGAGCCGGGCGTGTATCCCAAGAGCGGCCGGCGCATCCGCTTCACCCTGCCGTCGGGCCATGTCATGCACATCTATGCCGACAAGGAGAAGATCGGCAACGGCATGCCGACCCGCAACCCCGGCACCATTCCCGACGAAGGCTATATTCGCGGCTTCCGCTGCGTGCGGCTGGACCATGTGCTGCTGGGCGGACCCAACATCGTCGAGAACAGGGACATCTTCACCGGGATATTCGGCTTCACCGTCAGCGAGGAACTGGTCACGCAGGGGGACGAGACCAGGCTTGCGGTCTTCCTTTCCTGCTCCAACAAGCCGCATGACATCGCCTTCATCCTGCAACCGGATGGCAGCCGCTTCCACCATGTCTCCTTCCTGCTGGATTCGGTGAACGACCTGTTCCACGCGGGCGACCTGATCGGCAAATATGAAATCCCGGTCGACGTGTCGGTGAACCGCCATGGGGTGACGCGCGGCGCGACCATCTATTTCTTCGATCCGTCGGGCAACCGCAATGAAGTCTTCACCGGCGGCTATGTCCATTATCCCGACACGCCGACGCTGACCTGGGACACCAGCCAGTTGGGCAAGGCCACTTTCTCGCAGGACAATATGCCGCGCGAGAGCTTTCTGAACGTTCTGACCTGA所述的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因在降解芳香族化合物领域中的应用；所示的芳香族化合物优选为邻苯二酚、4-甲基邻苯二酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和2,6-二甲基-1,3,4-苯三酚中的至少一种；一种重组载体，包含上述邻苯二酚2,3-双加氧酶基因的核苷酸序列；所述的重组载体的制备方法，包含如下步骤：(1)以菌株Sphingbiumsp.MEA3-1的基因组DNA为模板，引物C23O-F和C23O-R作为扩增引物，进行PCR扩增，得到邻苯二酚2,3-双加氧酶基因片段；(2)对步骤(1)得到的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因片段和载体pET-29a(+)分别用NdeI和XhoI双酶切，将酶切后的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因片段和载体pET-29a(+)连接，转化，提取质粒，得到重组载体；所述的引物C23O-F和引物C23O-R的核苷酸序列如下所示：引物C23O-F：5’-CATATGGCGATTCGTGGATTGCTC-3’；引物C23O-R：5’-CTCGAGGGTCAGAACGTTCAGAAAGCT-3’；一种转邻苯二酚2,3-双加氧酶基因的工程菌，是通过将上述重组载体转化到表达宿主菌E.coliBL21(DE3)得到；一种重组邻苯二酚2,3-双加氧酶，是由上述转邻苯二酚2,3-双加氧酶基因的工程菌诱导表达、纯化、复性得到；所述的重组邻苯二酚2,3-双加氧酶的制备方法，包含如下步骤：(1)将转邻苯二酚2,3-双加氧酶基因的工程菌37℃培养至OD600nm至0.5～0.6，然后进行诱导表达，收集菌体并悬浮，超声破碎菌体细胞，离心得到上清液即为邻苯二酚2,3-双加氧酶粗酶液；(2)将步骤(1)制得的邻苯二酚2,3-双加氧酶粗酶液利用Ni-NTA亲和层析纯化，纯化后的酶液通过超滤透析去除咪唑后，在酶液中添加终浓度为0.1～0.5mM的Fe2+，得到重组邻苯二酚2,3-双加氧酶；步骤(1)中所述的诱导表达的条件为：加IPTG至终浓度为0.2mM，18℃继续培养24h；步骤(2)中所述的Ni-NTA亲和层析纯化的具体操作优选为：先用缓冲溶液A(20mMPBSpH8.0，300mMNaCl，0mM咪唑)平衡柱子，取粗酶液上样至Ni-NTA亲和层析柱，用缓冲溶液A洗脱，然后再分别用缓冲液B(20mMPBSpH8.0，300mMNaCl，20mM咪唑)、缓冲液C(20mMPBSpH8.0，300mMNaCl，50mM咪唑)、缓冲液D(20mMPBSpH8.0，300mMNaCl，100mM咪唑)、缓冲液E(20mMPBSpH8.0，300mMNaCl，250mM咪唑)和缓冲液F(20mMPBSpH8.0，300mMNaCl，500mM咪唑)进行梯度洗脱，收集洗脱液；步骤(2)中所述的Fe2+的终浓度优选为0.1～0.3mM；步骤(2)中所述的Fe2+的终浓度进一步优选为0.25mM；所述的重组邻苯二酚2,本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种邻苯二酚2,3‑双加氧酶基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种邻苯二酚2,3-双加氧酶基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因在降解芳香族化合物领域中的应用。3.根据权利要求1所述的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因在降解芳香族化合物领域中的应用，其特征在于：所示的芳香族化合物为邻苯二酚、4-甲基邻苯二酚、对苯二酚、1,2,4-苯三酚和2,6-二甲基-1,3,4-苯三酚中的至少一种。4.一种重组载体，其特征在于包含权利要求1所述的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因的核苷酸序列。5.权利要求4所述的重组载体的制备方法，其特征在于包含如下步骤：(1)以菌株Sphingbiumsp.MEA3-1的基因组DNA为模板，引物C23O-F和C23O-R作为扩增引物，进行PCR扩增，得到邻苯二酚2,3-双加氧酶基因片段；(2)对步骤(1)得到的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因片段和载体pET-29a(+)分别用NdeI和XhoI双酶切，将酶切后的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因片段和载体pET-29a(+)连接，转化，提取质粒，得到重组载体。6.根据权利要求5所述的重组载体的制备方法，其特征在于：所述的引物C23O-F和引物C23O-R的核苷酸序列如下所示：...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯颖，徐建强，邵嫄，尤晓颜，马丽苹，秦翠丽，牛明福，宫强，李阳，裴韬，王维宇，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南,41
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