一种通过转化系统素提高植物灰霉病抗性的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种通过转化系统素提高植物灰霉病抗性的方法，本方法通过基因工程技术将此基因转移到拟南芥中，使其在植物细胞中特异表达，可以显著提高其对灰霉病的抗性；本发明专利技术的方法具有广泛的实用性，可获得新型的具有高抗灰霉病性的植物品种。

【技术实现步骤摘要】
一种通过转化系统素提高植物灰霉病抗性的方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种提高植物抗病性的方法及其应用。
技术介绍
在自然界中，植物总是受到各种病原菌的侵袭。在长期的进化过程中，植物与病原物之间相互影响、相互适应、协同进化。一方面，植物为了生存，在进化中逐渐建立了一系列复杂的防御机制，能很好地协调对抗病原菌的侵染；另一方面，病原菌为了自身的利益也会通过调节植物防卫反应-信号转导途径来抑制诱导型防卫反应，打破植物体内的防御系统，最终使植物表现病症。植物与病原物互作过程中，植物体内发生一系列的信号传递，并激发植物的防御体系，使植物产生抗病性反应。系统素(systemin；SYS)是在植物中发现的第一个多肽激素，由18个氨基酸组成，目前被认为与伤信号传导有关。当植物受伤后，系统素由原系统素(prosystemin)的C-末端剪切和加工形成，进而被分泌到细胞外。SYS能够与质膜上的受体结合，启动胞内信号级联反应，导致下游信号分子茉莉酸(JA)的产生，进而诱导抗性基因表达。由于SYS仅在茄科的茄亚族中发现有SYS的同源序列，因此一直以来人们认为SYS不可能参与其它尤其是非茄科植物的抗性反应。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过转化系统素提高植物灰霉病抗性的方法。本专利技术提供提高植物抗病性的方法，是将缺失C末端4个氨基酸NNKL的番茄PS蛋白的编码基因LePS(ΔC)的转入植物中，得到抗病性增强的植物，尤其是灰霉菌(Botrytiscinerea)引起的灰霉病病害。一种蛋白质在如下a1)-a2)任一中的应用：a1)提高植物灰霉病抗性；a2)选育具有灰霉病抗性高植物品种；所述蛋白质为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或由序列1缺失第197-200位后所形成的蛋白质。一种蛋白质的编码基因或含有所述编码基因的重组载体在如下a1)-a2)任一中的应用：a1)提高植物灰霉病抗性；a2)选育具有灰霉病抗性高植物品种；所述蛋白质为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或由序列1缺失第197-200位后所形成的蛋白质。一种通过转化系统素提高植物灰霉病抗性的方法包括如下步骤：a)向目的植物中导入蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，灰霉病抗性得到提高的转基因植物；所述蛋白质为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或由序列1缺失第197-200位后所形成的蛋白质。其中序列1由200个氨基酸组成，编码LePS蛋白，其中第179-196位为所述系统素SYS成熟蛋白的编码序列，在所述方法中，所述编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pWM101、pGreen0029、pBI121、pBin19、pCAMBIA1301-UbiN等或其它衍生植物表达载体。在本专利技术中，所述重组表达载体具体为如下所述：将序列1的第1-196位氨基酸的编码DNA片段插入到pGFP221载体的酶切位点XbaI和KpnI之间后得到的重组质粒，命名为pGFP221-LePS(ΔC)-GFP。将序列1的第1-196位氨基酸的编码DNA片段插入到pGFP221载体的酶切位点XbaI和SacI之间后得到的重组质粒，命名为pGFP221-LePS(ΔC)。其中，序列1的第1-196位氨基酸的编码DNA片段，通过由LePS(ΔC)基因的序列设计引物PS-F、PS-R1(或PS-R2)，以番茄的cDNA为模板，扩增CusF的成熟序列，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的条带后连T载体，PS-F:5’-tctagaATGGGAACTCCTTCATATGATATCAAAAAC-3’PS-R1:5’-ggtaccCGTCTGTTTGCATTTTGGGAGGATC-3’PS-R2:5’-gagctcCGTCTGTTTGCATTTTGGGAGGATC-3’用质粒提取试剂盒提取含有LePS(ΔC)基因序列的T载体质粒，用限制性内切酶XbaI/KpnI酶切或XbaI/SacI，回收酶切产物；将其与经过同样双酶切的pGFP221载体的骨架片段相连，得到的重组载体即为pGFP221-LePS(ΔC)-GFP和pGFP221-LePS(ΔC)。在上述方法中，将携带有所述编码基因的所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、电击法/农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。在上述应用或方法中，所专利技术的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此被转化的植物即可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、小麦、水稻、玉米、苜蓿等。在上述应用或方法中，所述植物可为茄科植物或非茄科植物植物。在上述应用或方法中，所述植物具体为拟南芥哥伦比亚生态型。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：通过基因工程技术将此基因转移到拟南芥中，使其在植物细胞中特异表达，可以显著提高其对灰霉病的抗性；本专利技术的方法具有广泛的实用性，可获得新型的具有高抗灰霉病性的植物品种。附图说明图1为LePS(ΔC)-GFP融合蛋白的示意图，其中LePS(ΔC)-GFP融合蛋白将PS蛋白C段的4个氨基酸(NNKL)用GFP的序列所取代。图2为pGFP221-LePS(ΔC)-GFP载体示意图。图3为转基因植株的DNA水平鉴定PCR结果图。图4为RT-PCR分析转基因植株中LePS(ΔC)转录本水平结果图。图5为Westernblot分析转基因植株中LePS(ΔC)蛋白水平结果图。图6为pro35S::LePS(ΔC)-GFP转基因植物的灰霉病斑表型比对图。图7为pro35S::LePS(ΔC)-GFP转基因植物的灰霉病斑面积测定结果柱状图。具体实施方式下面结合附图与具体的实施方式对本专利技术作进一步详细描述：本专利技术所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。实施例中应用的生物材料的来源如下所述：番茄(Lycopersiconesculentum)、哥伦比亚野生型拟南芥(ArabidopsisColumbia)和病原菌为灰霉(Botrytiscinerea)均保藏于天津师范大学生命科学学院实验室。大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α购自上海唯地生物技术有限公司、农杆菌(Agrobacterium)GV3101购自北京华越洋生物公司。本专利技术的基因，是将来源于番茄(Lycopersiconesculentum)的PS基因GENBANK号为(NP_001296096.1)，如序列表中序列1所述，负责编码其蛋白序列中的C末端的4个氨基酸的密码子缺失，将所获得突变体基因命名为LePS(ΔC)。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。1、番茄LePS(ΔC)基因的克隆(1)根据LePS(ΔC)基因的序列设计引物PS-F:5’-tctagaATG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质在如下a1)‑a2)任一中的应用：a1)提高植物灰霉病抗性；a2)选育具有灰霉病抗性高植物品种；所述蛋白质为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或由序列1缺失第197‑200位后所形成的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质在如下a1)-a2)任一中的应用：a1)提高植物灰霉病抗性；a2)选育具有灰霉病抗性高植物品种；所述蛋白质为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或由序列1缺失第197-200位后所形成的蛋白质。2.一种蛋白质的编码基因或含有所述编码基因的重组载体在如下a1)-a2)任一中的应用：a1)提高植物灰霉病抗性；a2)选育具有灰霉病抗性高植物品种；所述蛋白质为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或由序列1缺失第197-200位后所形成的蛋白质。3.一种通过转化系统素提高植物灰霉病抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)向目的植物中导入蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，灰霉病抗性得到提高的转基因植物；所述蛋白质为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或由序列1缺失第197-200位后所形成的蛋白质。4.根据权利要求3所述的一种通过转化系统素提高植物灰霉病抗性的方法，其特征在于：所述编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海燕，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津,12