异位表达的不同基因组合及其在提高植物营养组织油含量的应用制造技术

本发明专利技术涉及异位表达的不同基因组合及其在提高植物营养组织油含量的应用，属于基因工程领域。选择四种分别参与不同油脂合成和积累过程的基因，即拟南芥

Different gene combinations of heterotopic expression and its application in improving oil content in plant nutrition tissue

The present invention relates to different gene combinations of heterotopic expression and its application in improving the oil content of plant nutrition tissue, which belongs to the field of genetic engineering. Four genes involved in the process of synthesis and accumulation of different oils, i. e. Arabidopsis, are selected.

【技术实现步骤摘要】
异位表达的不同基因组合及其在提高植物营养组织油含量的应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及异位表达的不同基因组合及其在提高植物营养组织油含量的应用。
技术介绍
植物油用途广泛，不仅是食用油的主要来源，而且可用于动物饲料、肥皂、表面活性剂、化妆品、涂料、润滑油，以及生物柴油的生产。据报道，食用油的消耗量在2030年之前将翻倍；化学工业界还寄望在20年后，植物油能取代40％的原油，因而对植物油的需求正急剧增加。然而，由于人口的增长和可耕地面积的减少，中国将面临食用油和化工原油短缺的严峻局面。人们寄希望通过提高和改变油料植物的农艺和品质性状(其中包括种子产量、油脂的含量及其脂肪酸组分)，使植物不仅是食用油的主要来源，而且还成为可持续地生产生物能源和化工原料的潜在工厂。通常情况下，油料植物生产植物油的主要场所在种子和果实中，营养器官中有的含量则很低，不足种子中油含量的百分之一，然而在某些逆境条件下或植物衰老过程中，叶片或茎秆中的油含量呈显著增加的趋势，这表明，营养器官中也存在“产油机器”，且在某些特定条件下，其运转效率可以得到增加。普遍认为，植物种子内油脂的合成和积累取决于以下四个关键因素：(1)将光合产物转化为脂肪酸的调控因子；(2)将脂肪酸链连接在甘油骨架上的脂肪酸酰基转移酶；(3)参与油脂降解的脂酶活性；(4)参与油滴形成和稳定的油脂蛋白。上述关键酶基因和调控因子在不同的亚细胞上被精确地调控，具有高度的时空协同性，而在营养组织中，尽管存有部分上述基因和调控因子，但表达量极低，且相互之间缺乏协同性(Chapmanetal.2013)。因此，若通过基因工程手段，在不同的亚细胞器内协同、有序地表达相关基因，同时降低脂肪酶的活性，能否将油料种子中的高效“产油机器”整合到植物营养器官中从而提高其产油能力成为本专利技术的研究课题。在经典的Kennedy途径中，Acyl-CoA：二酰甘油酰基转移酶(DGAT)被认为是参与种子油脂合成的关键限速酶，且发现衰老叶片中，此酶参与了TAG的合成，因此，为了剖析营养组织中脂肪酸组装到甘油骨架上的机制，一些研究致力于调查DGAT基因在组成型表达的启动子(如35S)调控下对植物营养器官中油合成的影响，结果显示，AtDGAT1基因在烟草幼苗中的过表达可使其TAG含量增至野生型的5.9倍，而转基因叶片中，TAG含量高达野生型的7倍。亦有研究表明，在营养组织中过表达脂肪酸合成途径中的关键酶基因或转录因子，能加速光合产物向脂肪酸的转化以及油脂的合成。丙二酰辅酶A是脂肪酸合成的重要前体，Klaus等发现，丙二酰辅酶A合成途径中的限速酶—乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的过表达可使马铃薯块茎积累中性的三酰甘油(TAG)。随后，Mendoza等在拟南芥中过表达参与种子成熟和油脂积累调控过程的转录因子LEAFYCOTYLEDON2(LEC2)，发现在营养组织中积累了种子特异的mRNA，并且储存性TAG含量有所增加，但与此同时，幼苗出现体细胞胚胎发生现象，且组织扭曲变形，影响转基因植株的正常生长。这说明，关键基因与合适启动子的有机结合对操控植物营养组织中油脂的合成和积累至关重要。但是，基于载体承受性和表达量的限制，选择何种基因组合并怎样合理地构建转录单元从而更好地实现基因均衡表达仍然是需要首先考虑和解决的技术问题。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的在于公开异位表达的不同基因组合及其在提高植物营养组织油含量的应用，构建表达载体，使其在植物营养器官中异位或异源表达参与种子油生产的关键基因，增强油脂合成与积累能力，有效地提高营养器官的含油量。在植物营养组织中异位表达的不同基因组合，含有所述的基因组合的表达载体引入以下模块：a、调控油脂合成的四种目的基因LEC2、DGAT1、OLEO2或GAT1中的至少一种；b、控制目的基因均衡表达的转录单元；c、多克隆位点。进一步的，所述表达载体为含有LEC2、DGAT1、OLEO2和GAT1基因组合的载体。进一步的，所述表达载体中启动LEC2基因表达的启动子为35S，终止该基因表达的终止子为NOS；启动DGAT1基因表达的启动子为35S，终止该基因表达的终止子为At4g25710基因的3’UTR；启动OLEO2基因表达的启动子为At4g25700基因的启动子，终止该基因表达的终止子为NOS；启动GAT1基因表达的启动子为35S，终止该基因表达的终止子为NOS。更进一步的，所述表达载体是以pBI121双元载体为骨架构建的。进一步的，目的基因还包括与LEC2、DGAT1、OLEO2或GAT1的核苷酸序列同源性达到90％以上的基因；或包括编码的氨基酸序列与拟南芥中LEC2、DGAT1或OLEO2编码的氨基酸序列，或与酿酒酵母中GAT1编码的氨基酸序列同源性达到95％以上的基因。进一步的，构建上述表达载体的方法，包括以下步骤：a、选择pBI121双元载体为构建骨架；在35S的5’端引入包括BamHI，XmaI，SmaI，XhoI和SacI的多克隆位点后将其插入pBI121中获得pBI121-35S；b、扩增35S-NOSDNA片段；然后在35S-NOSDNA片段的5’端加入KpnI-ClaI-StuI多酶切位点，3’端加入HindIII-ClaI-EcoRI多酶切位点，再通过KpnI和EcoRI将35S-NOSDNA片段克隆到载体pYES2中，获得中间载体pYES2-35S-NOS；c、以拟南芥基因组DNA为模板，扩增含有At4g25710基因的3’UTR和At4g25700基因的启动子(BCH1)及5’UTR的DNA片段，再在该DNA片段的5’端加入BamHI酶切位点，3’端加入SacI酶切位点，然后通过BamHI和SacI将该DNA片段插入到载体pYES2-35S-NOS中，获得中间载体pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-NOS；d、以拟南芥的cDNA为模板，扩增OLEO2目的基因，然后在OLEO2目的基因的5’末端和3’末端均加上SacI单酶切位点，再通过单酶切位点SacI将OLEO2目的基因克隆到载体pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-NOS，获得中间载体pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-OLEO2-NOS；e、以拟南芥的cDNA为模板，扩增DGAT1目的基因，然后在DGAT1目的基因的5’末端和3’末端均加上BamHI单酶切位点，再通过单酶切位点BamHI将DGAT1目的基因克隆到载体pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-OLEO2-NOS，获得中间载体pYES2-35S-3’UTR-DGAT1-BCH1-5’UTR-OLEO2-NOS，即pYES2-DGAT1-OLEO2；f、以酵母基因组为模板，扩增GAT1目的基因，在GAT1目的基因的5’端引入酶切位点BamHI，3’端引入酶切位点XhoI，通过BamHI和XhoI将GAT1目的基因克隆到载体pBI121-35S，构成单基因表达载体pBI121-35S-GAT1；然后将中间载体pYES2-DGAT1-OLEO2中的基因片段DGAT1-OLEO2通过ClaI位点克隆到载体pBI121-35S-GAT1，获得三基因植物表达载体p本文档来自技高网...

【技术保护点】
在植物营养组织中异位表达的不同基因组合，其特征在于：含有所述的基因组合的表达载体引入以下模块：调控油脂合成的四种目的基因

【技术特征摘要】
1.在植物营养组织中异位表达的不同基因组合，其特征在于：含有所述的基因组合的表达载体引入以下模块：调控油脂合成的四种目的基因LEC2、DGAT1、OLEO2或GAT1中的至少一种；控制目的基因均衡表达的转录单元；多克隆位点。2.如权利要求1所述的在植物组织中异位表达的不同基因组合，其特征在于：所述表达载体为含有LEC2、DGAT1、OLEO2和GAT1基因组合的载体。3.如权利要求1或2所述的在植物营养组织中异位表达的不同基因组合，其特征在于：所述表达载体中启动LEC2基因表达的启动子为35S，终止该基因表达的终止子为NOS；启动DGAT1基因表达的启动子为35S，终止该基因表达的终止子为At4g25710基因的3’UTR；启动OLEO2基因表达的启动子为At4g25700基因的启动子，终止该基因表达的终止子为NOS；启动GAT1基因表达的启动子为35S，终止该基因表达的终止子为NOS。4.如权利要求3所述的在植物营养组织中异位表达的不同基因组合，其特征在于：所述表达载体是以pBI121双元载体为骨架构建的。5.如权利要求1所述的在植物营养组织中异位表达的不同基因组合，其特征在于：所述目的基因还包括与LEC2、DGAT1、OLEO2或GAT1的核苷酸序列同源性达到90%以上的基因；或包括编码的氨基酸序列与拟南芥中LEC2、DGAT1或OLEO2编码的氨基酸序列，或与酿酒酵母中GAT1编码的氨基酸序列同源性达到95%以上的基因。6.如权利要求1所述的在植物营养组织中异位表达的不同基因组合，其特征在于：构建含有所述的基因组合的表达载体的方法，包括以下步骤：a、选择pBI121双元载体为构建骨架；在35S的5’端引入包括BamHI，XmaI，SmaI，XhoI和SacI的多克隆位点后将其插入pBI121中获得pBI121-35S；b、扩增35S-NOSDNA片段；然后在35S-NOSDNA片段的5’端加入KpnI-ClaI-StuI多酶切位点，3’端加入HindIII-ClaI-EcoRI多酶切位点，再通过KpnI和EcoRI将35S-NOSDNA片段克隆到载体pYES2中，获得中间载体pYES2-35S-NOS；c、以拟南芥基因组DNA为模板，扩增含有At4g25710基因的3’UTR和At4g25700基因的启动子（BCH1）及5’UTR的DNA片段，再在该DNA片段的5’端加入BamHI酶切位点，3’端加入SacI酶切位点，然后通过BamHI和SacI将该DNA片段插入...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛蕾蕾，雷洁，郑志富，甘毅，陈亚东，薛金嫚，刘宏波，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33