提高植物营养组织油含量的转基因方法及表达载体和应用技术

本发明专利技术涉及提高植物营养组织油含量的转基因方法及表达载体和应用，属于基因工程领域。选择

Transgenic method, expression vector and application for improving oil content in plant nutrition tissue

The invention relates to the method of improving the oil content of plant nutrient tissue, the expression vector and the application, which belong to the field of genetic engineering. Choice

【技术实现步骤摘要】
提高植物营养组织油含量的转基因方法及表达载体和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及提高植物营养组织油含量的转基因方法及表达载体和应用。
技术介绍
植物油用途广泛，不仅是食用油的主要来源，而且可用于动物饲料、肥皂、表面活性剂、化妆品、涂料、润滑油，以及生物柴油的生产。然而，由于人口的增长和可耕地面积的减少，在当前和今后很长的一段时间内，中国都将面临食用油和化工原油短缺的严峻局面。人们寄希望通过提高和改变油料植物的农艺和品质性状(其中包括种子产量、油脂的含量及其脂肪酸组分)，使植物不仅是食用油的主要来源，而且还成为可持续地生产生物能源和化工原料的潜在工厂。普遍认为，种子中油的生产涉及三个关键要素：(1)将光合产物有效地转化为脂肪酸；(2)将脂肪酸有效地掺入到甘油骨架上；(3)降低脂肪酸的降解。就此而言，油合成机器的主要元件也存在于营养器官中，这是因为：(1)作为油的主要组成成分，脂肪酸的主要合成部位是叶绿体或质体，而植物叶片富含叶绿体并提供脂肪酸合成所需的碳水化合物；(2)将脂肪酸组装到甘油骨架上形成油的酰基转移酶基因在营养器官中也有表达，这包括催化中性油脂三酰甘油合成的最后一步反应的二酰甘油酰基转移酶(DGAT1)基因；(3)在某些逆境条件下或植物衰老过程中，叶片或茎杆中油的含量呈显著增加的趋势。事实上，叶等营养器官是可收获的生物质的主要组成部分，叶片尤其为脂肪酸的合成提供最主要的碳源，因而，如果油合成机器的元件运作正常，叶等营养器官或许是理想的油脂积累的场所。不过，叶在进化过程中演变为“源”组织，成为高度专化的碳水化合物合成和输出的器官，缺乏脂质积累的倾向。我们假定营养器官中油合成机器的元件组合搭配不当或运转效率低下是造成低含油量性状的一个主要原因之一，若能将控制种子油合成的上述三个关键遗传要素有机地整合到植物营养器官中，油合成与积累能力将会得到增强。在经典的Kennedy途径中，3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)和Acyl-CoA：二酰甘油酰基转移酶(DGAT)分别将脂肪酸组装到甘油的sn-1、sn-2和sn-3位置上，DGAT被认为是参与种子油脂合成的关键限速酶，且发现衰老叶片中，此酶参与了TAG的合成。一些研究致力于调查DGAT基因在组成型表达的启动子(如35S)调控下对植物营养器官中油合成的影响，结果显示，AtDGAT1基因在烟草幼苗中的过表达可使其TAG含量增至野生型的5.9倍，而叶片中，可高达野生型的7倍。已有研究表明，在营养组织中过表达脂肪酸合成途径中的关键酶基因或转录因子，能加速光合产物相脂肪酸的转化以及油脂的合成。Mendoza等在拟南芥中过表达参与种子成熟和油脂积累调控过程的转录因子LEAFYCOTYLEDON2(LEC2)，发现在营养组织中积累了种子特异的mRNA，并且储存性TAG含量明显增加。与此一致的是，以为表达35S强启动子驱动的LEC2基因，可以有效提升拟南芥和烟草营养器官中的含油量。但与此同时，幼苗出现体细胞胚胎发生现象，且组织扭曲变形，影响转基因植株的正常生长。为解决这个问题，Kim等尝试通过衰老诱导表达的方式，在拟南芥叶片中过表达LEC2基因，其结果与野生型相比，转基因植株的TAG含量增加了3倍，且未出现明显的生长异常。这说明，关键基因与合适启动子的有机结合对操控植物营养组织中油脂的合成和积累至关重要。但是，基于载体承受性和表达量的限制，选择何种基因组合并怎样合理地构建转录单元从而实现基因表达仍然是需要首先考虑和解决的技术问题。酿酒酵母含有两个编码sn-1位的3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)基因GAT1和GAT2，催化甘油酯生物合成途径的第一步酰基化反应，虽然GAT1和GAT2同属于GPAT家族基因，且酵母Gat1p和Gatp2多肽中存在保守酰基转移酶特征序列，但是，以酿酒酵母为模式生物，通过构建GAT1和GAT2的基因敲除或过表达体系，发现GAT1和GAT2基因对酵母的诸多生理影响存在明显差异。另外，Oleosin蛋白在调节种子中脂质体稳定性方面具有重要作用，目前尚未将Oleosin基因与其它基因组合在一起，在油料作物的营养器官中进行共表达的研究，
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的在于提供提高植物营养组织油含量的转基因方法及表达载体和应用，该方法利用构建的表达载体，将其在植物营养组织中异位或异源表达，能显著提高植物营养组织中的油脂含量。一种提高植物营养组织油含量的表达载体，含有由GAT2、LEC2、DGAT1和OLEO2四种基因组成的基因组合。进一步的，所述GAT2基因为来源于酿酒酵母的SCT1-YBL011w，或与SCT1-YBL011w核苷酸序列同源性达90％以上的基因，或编码的氨基酸序列与SCT1-YBL011w氨基酸序列同源性达95％以上的基因。进一步的，所述LEC2基因为来源于拟南芥中的调控油脂积累的转录因子LEAFYCOTYLEDON2，或与该转录因子核苷酸序列同源性达90％以上的基因，或编码的氨基酸序列与该转录因子的氨基酸序列同源性达95％以上的基因。进一步的，所述DGAT1基因为来源于拟南芥的AT2G19450，或与AT2G19450核苷酸序列同源性达90％以上的基因，或编码的氨基酸序列与AT2G19450氨基酸序列同源性达95％以上的基因。进一步的，所述OLEO2基因为来源于拟南芥的AT5G40420，或与AT5G40420核苷酸序列同源性达90％以上的基因，或编码的氨基酸序列与AT5G40420氨基酸序列同源性达95％以上的基因。更进一步的，所述表达载体中启动LEC2基因表达的启动子为35S，终止该基因表达的终止子为NOS；启动DGAT1基因表达的启动子为35S，终止该基因表达的终止子为At4g25710基因的3’UTR；启动OLEO2基因表达的启动子为At4g25700基因的启动子，终止该基因表达的终止子为NOS；启动GAT2基因表达的启动子为35S，终止该基因表达的终止子为NOS。本专利技术还保护利用上述表达载体提高植物营养组织油含量的转基因方法，该方法包括以下步骤：步骤一、构建所述表达载体；步骤二、将表达载体进行根癌农杆菌转化，鉴定正确后获得阳性根癌农杆菌；步骤三、取植物叶片外植体进行组织培养，用阳性根癌农杆菌浸染，筛选并继续培养至生根，移栽种植；或将植物培养至花期，用阳性根癌农杆菌浸染花序后进行暗培养，最终获得转基因阳性植株；步骤四、取转基因阳性植株的叶片，进行分子鉴定和脂质分析，选择高油的转基因植株，成熟后收集种子，直至得到高油且稳定遗传的转基因株系。本专利技术还保护上述表达载体在提高植物营养组织中油含量上的应用。进一步的，所述植物为烟草、大豆、油菜、向日葵、花生、玉米或苜蓿。本专利技术另外还保护上述表达载体在提高与植物营养组织中油合成与积累相关联的物质生产中的应用，其中，所述与植物营养组织中油合成与积累相关的物质生产为脂溶性物质的生产。本专利技术的有益效果：1、本专利技术选择四种来源于拟南芥或酵母中的参与油脂合成与积累不同过程的基因GAT2、LEC2、DGAT1和OLEO2，通过与强度不同的启动子连接，使相应的基因在启动子的操控下，在植物营养组织中异位或异源表达，有效诱导营养细胞向胚性细胞转本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高植物营养组织油含量的表达载体，其特征在于：含有由

【技术特征摘要】
1.一种提高植物营养组织油含量的表达载体，其特征在于：含有由GAT2、LEC2、DGAT1和OLEO2四种基因组成的基因组合。2.如权利要求1所述的一种提高植物营养组织油含量的表达载体，其特征在于：所述GAT2基因为来源于酿酒酵母的SCT1-YBL011w，或与SCT1-YBL011w核苷酸序列同源性达90%以上的基因，或编码的氨基酸序列与SCT1-YBL011w氨基酸序列同源性达95%以上的基因。3.如权利要求1所述的一种提高植物营养组织油含量的表达载体，其特征在于：所述LEC2基因为来源于拟南芥中的调控油脂积累的转录因子LEAFYCOTYLEDON2，或与该转录因子核苷酸序列同源性达90%以上的基因，或编码的氨基酸序列与该转录因子的氨基酸序列同源性达95%以上的基因。4.如权利要求1所述的一种提高植物营养组织油含量的表达载体，其特征在于：所述DGAT1基因为来源于拟南芥的AT2G19450，或与AT2G19450核苷酸序列同源性达90%以上的基因，或编码的氨基酸序列与AT2G19450氨基酸序列同源性达95%以上的基因。5.如权利要求1所述的一种提高植物营养组织油含量的表达载体，其特征在于：所述OLEO2基因为来源于拟南芥的AT5G40420，或与AT5G40420核苷酸序列同源性达90%以上的基因，或编码的氨基酸序列与AT5G40420氨基酸序列同源性达95%以上的基因。6.如权利要求1-5任意一...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷洁，牛蕾蕾，郑志富，甘毅，薛金嫚，陈亚东，刘宏波，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33