一种高纯度亮丙瑞林的合成方法技术

本发明专利技术提供一种制备亮丙瑞林的方法，包括步骤：(1)由Fmoc‑Pro‑CTC‑OH和CTC树脂为起始原料，经处理得Fmoc‑Pro‑CTC树脂；(2)将Fmoc‑Pro‑CTC树脂采用Fmoc/tBu固相法逐一偶联的方式依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得侧链全保护的亮丙瑞林前体肽‑树脂；(3)以20％三氟乙醇/DCM溶液作为切割试剂，对侧链全保护的亮丙瑞林前体肽‑树脂进行切割，得侧链全保护的亮丙瑞林前体肽；(4)将侧链全保护的亮丙瑞林前体肽进行乙胺化，得侧链全保护亮丙瑞林；(5)对侧链全保护的亮丙瑞林进行侧链切割，得亮丙瑞林粗肽；(6)对亮丙瑞林粗肽进行CM纯化、HPLC纯化，浓缩，溶解、冻干，得高纯亮丙瑞林原料药。本发明专利技术方法操作简单，周期短，成本低，产品收率高，环境污染小，非常适于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度亮丙瑞林的合成方法
本专利技术涉及制药
，特别涉及一种固相法和液相法结合的高纯度亮丙瑞林合成方法。
技术介绍
亮丙瑞林，制剂中文名称为醋酸亮丙瑞林、抑那通或者简称亮丙瑞林，英文名称为Leuprorelinacetate、Enanton，Lucrin等。亮丙瑞林的适应症为子宫内膜异位症；伴有月经过多、下腹痛、腰痛及贫血等的子宫肌瘤；绝经前乳腺癌，且雌激素受体阳性患者；前列腺癌；中枢性性早熟症。临床主要用于前列腺癌及子宫内膜异位症。亮丙瑞林是1974年由日本武田化工的FujinoMasahiko等人首先发现，并且专利技术合成工艺，其作为促黄体激素释放激素的九肽酰胺类似物，具有很好的活性。其先后在日本、德国、美国等国家申请专利，专利号分别为JP19740027442、DE2446005、US4008209等。随后，又有一些研究机构和个人发表了一些合成工艺，专利号为EP1088555、EP1777232、US5480868等。在中国专利CN200610119341.6公开的制备方法为在粗品合成肽键接肽时采用机械搅拌，氨基酸单体、HOBt和DIC用DMF溶解后倒入树脂中，室温下反应1-2h。抽干溶剂，再以DMF洗涤8次、抽干，kaiser试剂检测反应是否完全。然而，机械搅拌死角较多，不利于反应充分混匀反应，脱保护产生的CO2和缩合反应产生的H2O，残留在反应液中，导致消耗更多的单体和试剂，并容易发生副反应，接肽反应率下降，粗品纯度和含量降低。在中国专利CN200910104993.6公开的制备方法为在亮丙瑞林粗肽制备时，将侧链全保护，即将亮丙瑞林10mmol加入到250ml反应瓶中，将配制好的裂解试剂200mL倒入至上述反应瓶中，室温反应2小时。反应结束，将反应液倒入至2000ml冰乙醚中，洗出大量白色沉淀，离心，洗涤，干燥称重得亮丙瑞林粗肽。裂解沉淀过程时，需要消耗大量乙醚，增加了生产成本和后期废液处理的成本，不利于工业化生产。同时，该法无法完全避免二酮哌嗪副反应，放大生产时，二酮哌嗪副反应造成肽链脱落，显著降低收率。目前已经公布的亮丙瑞林制备工艺都有着一定的缺陷，不能在操作复杂性、危险性、生产周期、产品总收率、产品成本和污染环境等方面达到一种较好的结合，应用价值不高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的亮丙瑞林的合成工艺，解决现有技术存在的缺陷。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种合成高纯度亮丙瑞林的方法，其包括以下步骤：(1)由Fmoc-Pro-CTC-OH和CTC树脂为起始原料，经反应得到Fmoc-Pro-CTC树脂；(2)将Fmoc-Pro-CTC树脂用Fmoc/tBu固相法以逐一偶联的方式依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得到侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-树脂；(3)配制体积比为20％的三氟乙醇的DCM溶液作为切割试剂，切割试剂冷却后加入，对侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-树脂进行切割，得到全保护亮丙瑞林前体肽；(4)将侧链全保护的亮丙瑞林前体肽进行乙胺化修饰，得到侧链全保护的亮丙瑞林；(5)对侧链全保护的亮丙瑞林进行侧链切割，得到亮丙瑞林粗肽；(6)对亮丙瑞林粗肽进行CM纯化、HPLC纯化，浓缩，溶解、冻干，得到高纯度的亮丙瑞林原料药。在本专利技术方法的步骤(1)中，以DCM作为反应的溶剂。具体来说，用DCM将CTC树脂溶胀，溶胀时间为0.8-1h，加入反应釜中；用DCM将Fmoc-Pro-OH溶解后，加入一定量的DIEA，然后再加入到反应釜中；从反应釜底部通入氮气，反应时间为2-3h；反应完成后，对树脂进行封头，配制甲醇：DIEA：DCM(体积比1∶1∶2)的混合溶液，加入反应釜中，继续通入氮气振摇反应，将反应液抽干，用DMF洗涤2-6次。在现有的技术文献中，大部分的科研人员选用了HMPB-AM树脂或Wang树脂作为起始原料。然而，本专利技术的科研人员在长期的实验过程中发现，使用该两种树脂均十分容易产生副反应：二酮哌嗪反应，特别是Wang树脂，该副反应主要出现在第一个氨基酸为Pro的时候，当第二个氨基酸脱FMOC的时候，α-氨基被游离出来之后，立即对Wang树脂的苄酯键进行分子内胺解，生成六元环二酮哌嗪衍生物，同时从Wang树脂上释放出来，导致反应终止。该反应非常迅速，文献报道采用50％Pip/DMF，脱1min，4min的条件，但是我们实验证明在多数情况下，即使是1min左右反应就超过了20％。因此，经过理论摸索和实践验证，我们尝试了采用2-Cl-Trt树脂合成，该树脂的巨大空间阻力完全消除了该副反应。同时，在步骤(1)中，采用了氮气搅拌，可以使反应更加充分地进行，并意想不到地通过带走反应产生的H2O，降低反应中氨基酸单体数量至1.5倍。本专利技术方法的步骤(2)所述的具有保护基团的氨基酸采用Fmoc基团保护，各种氨基酸分别以Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和pGlu的形式应用。本专利技术方法的步骤(2)所述的Fmoc保护基通过20％哌啶/DMF溶液处理来除去。在本专利技术方法的步骤(2)所述的逐一偶联时，氨基酸相对于合成规模的投料比为1-6倍；所述逐一偶联剂的体系是DCC/HOBt，或者是EDC/HOBt，或者是DIC/HOBt，或者是DIC/HOAt，或者是PyBOP/HOBt，或者是PyAOP/HOAt，或者是TBTU/HOBt，或者是HBTU/HOBt，或者是HCTU/HOCt，或者是HATU/HOAt；偶联反应溶剂是四氢呋喃(THF)，或者是二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，或者是二氯甲烷(DCM)，或者是N-甲基吡咯烷酮(NMP)，或者是二甲基亚砜(DMSO)；偶联反应的有机碱是N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，或者是三乙胺(TEA)，或者是N-甲基吗啡啉(NMM)，或者是2,4,6-三甲基吡啶(TMP)；偶联反应时间为1-3小时。本专利技术方法的步骤(3)所述的切割试剂，根据亮丙瑞林前体肽-树脂的质量多少进行投料，每克干燥树脂配制10ml切割试剂。在本专利技术方法的步骤(4)所述的乙胺化修饰中，需加入HATU、2,4,6-三甲基吡啶、乙胺作为反应试剂，反应在25℃恒温进行，搅拌，反应0.5-3h。在本专利技术方法的步骤(4)所述的乙胺化修饰中，加入HATU、2,4,6-三甲基吡啶作为反应试剂。其中，前体肽、HATU、2,4,6-三甲基吡啶三者的摩尔比为1∶2-3∶1.5-2；最佳地，三者的摩尔比为1∶2∶2。本专利技术方法的步骤(4)所述的实验过程是将侧链全保护的亮丙瑞林前体肽进行乙胺化修饰，得到侧链全保护的亮丙瑞林。在现有的文献中，公开的实验方案虽多，但是实验反应所需的时间均在12-24小时之间，通常需要反应过夜。本专利技术的步骤(4)在已公开的实验技术基础上，反复优化实验条件，使得反应进行所需的时间大大地得到缩短，仅需0.5-3h即可完成。优选地，步骤(4)所述的乙胺化修饰得到侧链全保护的亮丙瑞林的反应时间为1h。本专利技术的步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固相法和液相法结合的制备亮丙瑞林的方法，其包括以下步骤：1)将CTC树脂置于反应釜中，加入DCM溶胀；将Fmoc‑Pro‑OH溶解于DCM，加入DIEA混匀后，加入到反应釜中，从反应釜底部通入氮气，进行搅拌、反应；配制甲醇∶DIEA∶DCM混合溶液，加入反应釜中，继续通入氮气振摇反应，将反应液抽干，用DMF洗涤，得到Fmoc‑Pro‑CTC树脂；2)将Fmoc‑Pro‑CTC树脂用Fmoc/tBu固相法以逐一偶联的方式依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得到侧链全保护的亮丙瑞林前体肽‑树脂；3)配制三氟乙醇/DCM溶液作为切割试剂，浓度优选为20％v/v，切割试剂冷却后，加入到反应釜中反应，对侧链全保护的亮丙瑞林前体肽‑树脂进行切割，得到侧链全保护的亮丙瑞林前体肽；4)将侧链全保护的亮丙瑞林前体肽进行乙胺化修饰，向反应釜中加入HAT U、2,4,6‑三甲基吡啶、乙胺作为反应试剂，搅拌，反应0.5‑3h，得到侧链全保护的亮丙瑞林；5)对侧链全保护的亮丙瑞林进行侧链切割，切割液为TFA/水混合溶液，混合比优选体积比95/5，先低温下加入侧链全保护的亮丙瑞林，再缓慢恢复至室温，反应1.5‑3.5h，低温下旋蒸、沉淀、离心，得到亮丙瑞林粗肽；6)对亮丙瑞林粗肽进行CM纯化、HPLC纯化，浓缩，溶解、冻干，得到高纯度的亮丙瑞林原料药。...

【技术特征摘要】
1.一种固相法和液相法结合的制备亮丙瑞林的方法，其包括以下步骤：1)将CTC树脂置于反应釜中，加入DCM溶胀；将Fmoc-Pro-OH溶解于DCM，加入DIEA混匀后，加入到反应釜中，从反应釜底部通入氮气，进行搅拌、反应；配制甲醇∶DIEA∶DCM混合溶液，加入反应釜中，继续通入氮气振摇反应，将反应液抽干，用DMF洗涤，得到Fmoc-Pro-CTC树脂；2)将Fmoc-Pro-CTC树脂用Fmoc/tBu固相法以逐一偶联的方式依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得到侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-树脂；3)配制三氟乙醇/DCM溶液作为切割试剂，浓度优选为20％v/v，切割试剂冷却后，加入到反应釜中反应，对侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-树脂进行切割，得到侧链全保护的亮丙瑞林前体肽；4)将侧链全保护的亮丙瑞林前体肽进行乙胺化修饰，向反应釜中加入HATU、2,4,6-三甲基吡啶、乙胺作为反应试剂，搅拌，反应0.5-3h，得到侧链全保护的亮丙瑞林；5)对侧链全保护的亮丙瑞林进行侧链切割，切割液为TFA/水混合溶液，混合比优选体积比95/5，先低温下加入侧链全保护的亮丙瑞林，再缓慢恢复至室温，反应1.5-3.5h，低温下旋蒸、沉淀、离心，得到亮丙瑞林粗肽；6)对亮丙瑞林粗肽进行CM纯化、HPLC纯化，浓缩，溶解、冻干，得到高纯度的亮丙瑞林原料药。2.根据权利要求1所述的制备亮丙瑞林的方法，其中步骤4)中的侧链全保护的亮丙瑞林前体肽与HATU、2,4,...

【专利技术属性】
技术研发人员：单连民，刘兵，王林鹏，安宁，万龙岩，张道桂，江晓漫，
申请(专利权)人：上海丽珠制药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31