贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶发酵液的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶发酵液的制备方法及其应用，具体是在促进乳猪生长中的应用，产蛋白酶发酵液的制备方法包括：A、将分离自猪粪便中的贝莱斯芽孢杆菌接种于发酵培养基中，于21℃‑53℃下发酵培养48‑72h，B、经步骤A发酵后，将发酵液于4℃、4000rpm条件下离心20min，取上清液，即得发酵液。通过对发酵培养基及培养方法的优化以提高贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶的能力，并将该发酵培养液添加入乳猪日粮中以促进乳猪的生长。

Preparation and application of protease producing fermentation broth of Bacillus Velez

The present invention relates to Velez Protease Fermentation Liquid bacillus preparation method and application thereof, in particular to promote the application of piglet growth, including the preparation method of Producing Protease Fermentation Liquid: A, separating Velez Bacillus inoculation from swine feces in the fermentation medium, 21 DEG C to 53 DEG C Fermentation 48 72h B, culture, through the process of A fermentation, the fermentation liquid at 4 DEG C, under the condition of 4000rpm centrifugal 20min, the supernatant of fermentation broth, i.e.. Through optimization of fermentation medium and culture method, the ability of protease produced by Bacillus Velez was increased, and the fermentation medium was added to the diet of suckling pig to promote the growth of suckling pig.

【技术实现步骤摘要】
贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶发酵液的制备方法及其应用
本专利技术涉及微生物领域，具体地说是一种贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法及在促进乳猪生长中的应用。
技术介绍
蛋白酶是催化蛋白水解的一类酶，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，广泛应用于食品、纺织、医药、有机合成、洗涤剂及制革脱毛等领域，其份额占整个酶制剂市场的一半以上。蛋白酶可以从动植物中提取，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等；也可以通过微生物发酵工艺进行生产，如固态发酵法和液态发酵法等。益生菌的代谢产物能促进动物生长，抑制病害发生。可以提高动物对于饲料的利用水平，提高利用率，从而降低购买饲料的成本；益生菌可以除臭，改善饲养环境；还能够增进动物健康，有效控制预防细菌和寄生虫以及呼吸系统疾病的预防；促进动物快速生长，从而缩短饲养的时间；减少使用抗生素，提高禽肉蛋、绿色禽畜产品的质量。贝莱斯芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界。贝莱斯芽孢杆菌具有十种不同的抗生素合成能力，包括一些聚酮类化合物、脂肽类化合物、多肽类化合物等，是一种具有高效生防性能和植物促生活性的土壤细菌。目前，关于贝莱斯芽孢杆菌的报道多集中于其生防功能的研究。但对该菌产蛋白酶的条件及在动物生长中的应用还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法，通过对发酵培养基及培养方法的优化以提高贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶的能力，并将该发酵培养液添加入乳猪日粮中以促进乳猪的生长。所述贝莱斯芽孢杆菌分离自猪粪中，其基因如序列SEQIDNo：1所示。所述贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法，具体包括如下步骤：A、将分离自猪粪便中的贝莱斯芽孢杆菌接种于发酵培养基中，于21℃-53℃下发酵培养48-72h，B、经步骤A发酵后，将发酵液于4℃、4000rpm条件下离心20min，取上清液，即得发酵液。进一步，所述发酵培养基是由碳源、氮源和金属离子配制而成的水溶液；；所述碳源和氮源总质量与水的比例为1g：50ml；所述碳源、氮源的质量比为2：3；所述金属离子加入量与水的比例为1g：100ml。进一步，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉的组合物，按质量比2.5：3：3.8比例混合而成。进一步，所述氮源为黄豆粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏的组合物，按质量比3：0.5：1.25:0.75比例混合而成。进一步，所述金属离子为Ca2+、Mg2+、K+、Cu2+离子组合物，按摩尔比2：1：1：0.75比例混合而成。进一步，所述培养基的pH值为7.0。本专利技术提供一种贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法，通过对发酵培养基及培养方法的优化以提高贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶的能力，并将该发酵培养液添加入乳猪日粮中以促进乳猪的生长。本专利技术贝莱斯芽孢杆菌为芽孢杆菌一个新的品种，它可以产生能诱导全身抗性并同时抑制真菌生长的化合物，能够直接抑制真菌和细菌病原体的生长，并可以使猪尽量免于真菌和细菌的侵害。加入饲料也可以减少对猪抗生素的使用，可以保护猪的肝脏，减少抗生素对肝脏的损害。附图说明图1是菌株筛选结果(10-5平板)。图2是四区划线法对筛选出的单菌落进行纯化的结果。图3是革兰氏染色镜检结果。图4是PCR扩增产物电泳图。图5是阳性克隆菌落PCR结果。图6是发酵培养时间对酶活力的影响。图7是发酵培养温度对酶活力的影响。图8是发酵培养pH对酶活力的影响。图9是发酵培养装液量对酶活力的影响。图10是发酵培中碳氮源比例变化对酶活力的影响。具体实施方式以下结合附图通过具体实施例对本专利技术技术方案做进一步解释说明。实施例1菌株的分离鉴定1材料与方法1.1实验材料干燥猪粪。1.1.1实验主要试剂琼脂粉、LB肉汤、细菌基因组DNA快速提取试剂盒、多功能DNA纯化回收试剂盒、琼脂糖G-10、PremixTaq酶、6×loadingbuffer、DNAmarker、AL2000、革兰氏染色液。1.1.2实验仪器烧杯(50、500mL)、量筒(10、100mL)、锥形瓶(50、100、200mL)、容量瓶(50、100、1000mL)、玻璃棒、培养皿、试管(25mL)、电热恒温水浴锅、移液枪(1000μL200μL20μL10μL)、分析天平(0.0001)、烘箱、PCR仪、DYY-8B型稳压稳流电泳仪、超净工作台、电热手提高压蒸汽消毒器、Tanon-1600凝胶成像系统、摇床。以及报纸、棉绳、镊子、医用棉花、擦镜纸、玻璃棒、药匙、接种环、三角型涂布棒、封口胶(PM-996)、酒精灯等。1.1.3培养基配方LB固体培养基(100mL)：LB肉汤2.5g，琼脂粉2％，PH7.2-7.4，121℃/20min高压蒸汽灭菌；LB液体培养基(100mL)：LB肉汤2.5g，PH7.2-7.4，121℃/20min高压蒸汽灭菌；氨苄抗性固体LB培养基(100ml)：LB肉汤2.5g，琼脂粉2％，PH7.2-7.4，121℃/20min高压蒸汽灭菌。冷却培养基至55℃，加入150μl氨苄搅拌均匀，倒平板，待平板冷却后于4℃储存。1.2菌种的筛选和培养1.2.1菌种的筛选准备六瓶10mL的蒸馏水，于121℃/20min高压蒸汽灭菌。称取0.1g的待测样品加入无菌水中，溶解摇匀，并依次稀释获得10-5、10-6、10-7、10-8这四个浓度的样品溶液，将10-5、10-6、10-7、10-8这四个浓度的样品溶液分别取100μL滴加在平板表面，再用三角形的无菌玻璃涂布棒将菌液均匀涂布于LB固体培养基上。将平板置于28℃培养30小时，期间不断查看,记录下菌落的生长情况。将平板从培养箱中取出，观察并从生长单菌落的平板上挑选单菌落，用四区划线法来纯化单菌落，将LB固体培养基分为四个等大的扇形区域，用灼烧后的接种环从上一步长出单菌落的平板挑取单菌落，在扇形区域划线，将平板置于28℃培养24h。从四区划线的平板上挑选单菌落接种于LB固体斜面上，将LB固体斜面放置于28℃培养30h。1.2.2菌种的培养从LB固体斜面挑去单菌落接种至LB液体培养基(20mL)中，置于摇床200r/37℃培养12h。1.3菌种基因组DNA的提取1.3.1革兰氏染色(1)涂片首先在载玻片上面滴一小滴蒸馏水，将接种环在酒精灯上灼烧后，从LB固体斜面培养基上挑取少量细菌，置于载玻片的水滴中与水混合，将水滴涂抹开。涂抹过程中应尽量使菌体分散开，使得后面能够充分染色。(2)固定将载玻片在火焰上方快速来回通过1-2次，以载玻片的加热不能过烫，冷却，重复上述的操作3-4次至载玻片上涂抹的薄层干；(3)染色将一滴草酸铵结晶紫染液(草酸铵+结晶紫+乙醇)滴在载玻片的薄层上，染色1分钟，用自来水冲洗。注意不要让水流直接对准薄层；(4)媒染对准薄层加一滴卢戈式碘液(碘+碘化钾)，作用1分钟，用自来水水冲洗。注意,不要让水流直接冲上薄层，冲洗完成后，用滤纸将水吸干；(5)脱色在载玻片上滴加95％的乙醇，使薄层脱色，脱色30秒。这一步注意把握好脱色的时长；(6)水洗用滤纸将载玻片上的乙醇吸干；(7)复染在载玻片上滴加一滴0.5％的番红染液(番红O+乙醇)，染色10～30秒后，用自来水冲洗；不要让水流直接往薄层上冲。(8)观察干燥后，在显微镜下本文档来自技高网...

【技术保护点】
贝莱斯芽孢杆菌在在促进乳猪生长中的应用。

【技术特征摘要】
1.贝莱斯芽孢杆菌在在促进乳猪生长中的应用。2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在在促进乳猪生长中的应用，其特征在于，所述应用是将贝莱斯芽孢杆菌发酵液添加进动物饲料中。3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在在促进乳猪生长中的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌的基因如序列SEQIDNo：1所示。4.一种贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法，其特征在于，包括如下步骤：A、将分离自猪粪便中的贝莱斯芽孢杆菌接种于发酵培养基中，于21℃-53℃下发酵培养48-72h，B、经步骤A发酵后，将发酵液于4℃、4000rpm条件下离心20min，取上清液，即得发酵液。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基是由碳源、氮源...

【专利技术属性】
技术研发人员：王在贵，叶淼，张宽朝，杨章泽，洪君衍，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34