一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法技术

一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法，其目的是通过生物化学方法直接测定人或动物血液中抗体的氨基酸序列。本方法包括的步骤为：A、将与特定抗原结合的特异性抗体从血液或血液制品中分离；B、将分离的特异性抗体采用蛋白酶酶切产生抗体片段；C、将得到的抗体片段采用SDS‑PAGE电泳与离子交换色谱、正向色谱、反向色谱、二维电泳或等电聚焦电泳分离，得到不超过五个不同氨基酸序列抗体片段的组分；D、将分离的抗体片段组分切割成5到60个氨基酸的肽段；E、测定所得到肽段的氨基酸序列；和F、将测定的肽段氨基酸序列通过重叠部分拼接成抗体序列。

【技术实现步骤摘要】
一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法
本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法。
技术介绍
抗体是机体在抗原物质作用下，由B细胞分化所产生的、可与相应抗原特异性结合的一类特殊蛋白质。抗体存在于血液等体液，及B细胞的细胞膜表面，是免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒的武器。抗体的性质是由抗体的氨基酸序列决定的，因此测定一个抗体的氨基酸序列是研究其化学生物性质的重要内容。过去的几十年中，为了测定特异性抗体的氨基酸序列，人们把注意力转向产生抗体的B细胞。因为每个特异性的抗体都是由一个特异性的B细胞产生，只要筛选出产生某种特异性抗体的B细胞，便得到一个单一的B细胞培养繁殖的细胞群，就会只产生单一序列的抗体。在克隆化的单一B细胞群中通过分子生物学的手段可以分离产生抗体的mRNA，然后把mRNA反转录成cDNA即可测出抗体的基因编码，由此推断出抗体的氨基酸序列(ChaddHE,ChamowSM(2001).Therapeuticantibodyexpressiontechnology.Curr.Opin.Biotechnol.12(2):188–94.)。但是，至今为止无法实现B细胞在体外的培养和繁殖。为了解决这个困难，1975年生物化学家CKohler和C.Milstein创立了杂交瘤细胞技术，培养出具有无限繁殖能力又能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞(hybridoma)(G.&C.Milstein(1975).Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.Nature256(5517):495–7)。采用这种方法能够得到大量的均一的抗体，且抗体的氨基酸序列和特异性一致。目前世界上的单克隆抗体都是由这个方法制备的，抗体序列的测定是基于克隆化的杂交瘤细胞中产生抗体的mRNA序列推断，或利用杂交瘤细胞产生的单克隆抗体通过蛋白质测序而得到。然而，杂交瘤技术具有较大的局限性：第一，杂交瘤细胞产生抗体的技术只能应用于少数几种动物，主要为小鼠和大鼠，本领域的技术人员认为杂交瘤技术不能制备人源的抗体，而人源抗体在疾病的诊断和医疗上有极其广泛的应用。第二，杂交瘤技术得到的单克隆抗体往往亲合力较低，能产生高亲合力抗体的细胞可能会在杂交瘤细胞的筛选过程中被淘汏掉。如果有一种方法能够直接测定血液中与某种抗原结合的特异性抗体的氨基酸序列，人们就能够应用分子生物学技术在体外培养的细胞中(如CHO,HEK293细胞)直接生产出单一序列的抗体。这将会补充目前应用的杂交瘤细胞技术的不足，得到性能更好的或者有新的应用的抗体。然而，动物和人血液中存在1012～1015不同序列的抗体，这些抗体有着极其相似的三维结构。抗体作为糖蛋白具有复杂的结构，且抗体分子是由四条链组成分子量大于150KD大分子。从血液中分离出针对某个抗原的特异性抗体并测定出这些特异性抗体的氨基酸序列有很大的困难，本领域技术人员公认为不可能实现。基于上述状况，本专利技术提供了一种直接测定血液中抗体氨基酸序列的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法。在一个实施方案中，公开了一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法，其包括的步骤为：A、将与特定抗原结合的特异性抗体从血液或血液制品中分离；B、将步骤A中分离的特异性抗体采用蛋白酶酶切产生抗体片段，所述抗体片段包括F(ab’)2、Fab或Fc；C、将步骤B中得到的抗体片段采用一维聚丙烯酰胺电泳与离子交换色谱、正向色谱、反向色谱、二维聚丙烯酰胺电泳或等电聚焦电泳分离，得到不超过五个不同氨基酸序列抗体片段的组分；D、将步骤C中分离的每个抗体片段进一步切割成5-60的肽段，所述切割方法为采用蛋白酶切割法或化学反应切割法，其中所述蛋白酶切割法采用至少三种蛋白酶切割；E、测定步骤D中所得到肽段的氨基酸序列；F、将步骤E中测定的肽段氨基酸序列通过重叠部分拼接成抗体序列。进一步的，所述步骤A中，利用抗原和抗体特异性结合的原理将与特定抗原结合的特异性抗体从血液中分离采用亲和层析法。所述亲和层析法可以是抗原亲和层析，也可以是抗原结构类似物亲和层析。所述步骤B中采用的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或者IDES(SEQIDNO:7)，所述酶切产生的抗体片段，包括F(ab’)2、Fab或Fc，便于将抗体分子分离成更简单的组分。优选的蛋白酶为IDES(SEQIDNO:7)。所述步骤C中采用离子交换色谱、反相色谱、一维聚丙烯酰胺电泳和二维聚丙烯酰胺电泳逐步将步骤B中的抗体片段分离成含有至多两个氨基酸序列的抗体片段组分。所述步骤D中的蛋白酶选自：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酸蛋白酶、精氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、链霉素蛋白酶E、弹性蛋白酶。选择四到六种不同的蛋白酶酶切步骤C中分离的抗体组分。进一步的所述步骤D中蛋白酶包括胰蛋白酶(trypsin)。所述步骤C中每个抗体片段组分进一步切割成5到40个氨基酸的肽段，所述步骤E中采用质谱分析方法测定抗体肽段的氨基酸序列。所述步骤C中每个抗体片段组分进一步切割成20到60个氨基酸的肽段，所述步骤E中采用Edman降解法测定抗体肽段的氨基酸序列。进一步的，所述测定血液中抗体氨基酸序列的方法还包括在步骤A前采用A蛋白亲和层析柱分离血液或血液组分中IgG抗体。所述步骤B前还可以包括，去除抗体分子上的化学修饰，如糖基化，例如采用肽N-糖苷酶F酶去除抗体分子上的N-糖基。所述步骤A中，所述血液可以是进行一些前期处理得到包含抗体的血液制品，所述前期处理方法可以是物理化学手段，如去掉血液中与抗体无关的成分，或富集含抗体的成分。所述血液可以取自经历天然的或人为的免疫过程的动物或人身体。本专利技术适用于测定脊椎动物血液中抗体的氨基酸序列，所述脊椎动物选自人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、骆驼、猴子或猩猩。测定的抗体氨基酸序列可以是抗体的全部序列，可以只包括抗体可变区的序列大约包括220氨基酸，测定的结果可以是一种抗体的序列，也可以是多种抗体的序列。附图说明和序列表：根据以下的专利技术详细描述和附图及序列表，可以更全面地理解本专利技术，以下的专利技术详细描述和附图及序列表构成本申请的一部分。图1为抗体和抗体片段结构示意图。血液中大多数抗体是由两条重链和两条轻链组成对称结构，可包含由二硫键互连的至少两条重链和两条轻链；Fab指抗体在铰链区重链间二硫键近N端处切断，形成两个相同的单价抗原结合片段，Fc指形成的可结晶片段。图2抗体片段示意图。图3为实施例1和实施例2实验所用抗原的SDS-PAGE图。A是非还原的PD-L1，B是还原的PD-L1。图4为实施例1中凝胶电泳分离的洗脱的PD-L1特异抗体。第一条带是标准蛋白标志物，第二和第三条带是不与PD-L1亲和柱结合的非特异抗体，第四条带是pH8缓冲液清洗的流出物，第五到第九条带是pH3甘氨酸洗脱组分，每个组分收集1毫升，大部分的抗体在第二和第三组分流出。序列描述以及关联的序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法，其包括的步骤为：A、将与特定抗原结合的特异性抗体从血液或血液制品中分离；B、将步骤A中分离的特异性抗体采用蛋白酶酶切产生抗体片段，所述抗体片段包括F(ab’)2、Fab或Fc；C、将步骤B中得到的抗体片段采用一维聚丙烯酰胺电泳与离子交换色谱、正向色谱、反向色谱、二维聚丙烯酰胺电泳或等电聚焦电泳分离，得到不超过五个不同氨基酸序列抗体片段的组分；D、将步骤C中分离的每个抗体片段组分进一步切割成5‑60个氨基酸的肽段，所述切割方法为采用蛋白酶切割法或化学反应切割法，其中所述蛋白酶切割法采用至少三种蛋白酶；E、测定步骤D中所得到肽段的氨基酸序列；F、将步骤E中测定的肽段氨基酸序列通过重叠部分拼接成抗体序列。

【技术特征摘要】
1.一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法，其包括的步骤为：A、将与特定抗原结合的特异性抗体从血液或血液制品中分离；B、将步骤A中分离的特异性抗体采用蛋白酶酶切产生抗体片段，所述抗体片段包括F(ab’)2、Fab或Fc；C、将步骤B中得到的抗体片段采用一维聚丙烯酰胺电泳与离子交换色谱、正向色谱、反向色谱、二维聚丙烯酰胺电泳或等电聚焦电泳分离，得到不超过五个不同氨基酸序列抗体片段的组分；D、将步骤C中分离的每个抗体片段组分进一步切割成5-60个氨基酸的肽段，所述切割方法为采用蛋白酶切割法或化学反应切割法，其中所述蛋白酶切割法采用至少三种蛋白酶；E、测定步骤D中所得到肽段的氨基酸序列；F、将步骤E中测定的肽段氨基酸序列通过重叠部分拼接成抗体序列。2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤A中采用亲和层析法将与特定抗原结合的特异性抗体从血液中分离。3.根据权利要求2所述的方法，亲和层析法中抗原作为亲和层析的配体。4.根据权利要求2所述的方法，亲和层析法中抗原结构类似物作为亲和层析的配体。5.根据权利要求1所述的方法，所述步骤B中采用蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或者IDES(SEQIDNO:7)。6.根据权利要求5所述的方法，所述步骤B中采用的蛋白酶是IDES(SEQIDNO:7)。7.根据权利要求1所述的方法，所述步骤C中采用离子交换色谱、反相色谱、一...

【专利技术属性】
技术研发人员：张效龙，金茜，
申请(专利权)人：张效龙，金茜，
类型：发明
国别省市：北京,11