高荧光强度的荧光探针的合成方法及用其进行β受体激动剂检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种高荧光强度的荧光探针的合成方法及用其进行β受体激动剂检测的方法，属于食品安全检测领域。该高荧光强度的荧光探针的合成方法，以2,3‑萘二胺、苯甲酰氯为反应物，以1‑丁基‑3‑甲基咪唑六氟磷酸盐为催化剂制得。该荧光探针荧光强度高，合成简便，针对含有氨基化合物反应特异性强。所生成的荧光探针与β‑受体激动剂衍生速度快，荧光强度高。增加该类药物检测灵敏度，降低了检测成本。

Synthesis of fluorescent probes with high fluorescence intensity and methods for the detection of beta receptor agonists

The invention discloses a method for synthesizing a fluorescent probe with high fluorescence intensity and a method for detecting beta receptor agonist, and belongs to the field of food safety detection. Synthesis of fluorescent probe the high fluorescence intensity, 2,3 naphthalene amine, two benzoyl chloride as reactant, catalyst prepared by 1 butyl 3 2-methylimidazole six fluoride phosphate. The fluorescence probe has high fluorescence intensity, simple synthesis and strong reaction specificity for amino compounds. The generated fluorescence probe and beta agonists derived fast, high fluorescence intensity. The sensitivity of this kind of drug detection is increased and the cost of detection is reduced.

【技术实现步骤摘要】
高荧光强度的荧光探针的合成方法及用其进行β受体激动剂检测的方法
本专利技术属于食品安全检测领域，具体涉及一种高荧光强度的荧光探针的合成方法及用其进行β受体激动剂检测的方法。
技术介绍
β-受体激动剂被广泛使用在禽畜饲养过程中，可以促进动物生长，提高瘦肉产率。但长期使用会富集在动物组织中，人食用该动物组织会产生很严重的毒副作用，从而危害人类健康。国家食品安全领域强制执行检测动物源性制品中莱克多巴胺、沙丁胺醇、克伦特罗三种传统的β-受体激动剂，而对新型的β-受体激动剂暂时没有相应的检测标准，如：西马特罗、苯乙醇胺A、特布他林、福莫特罗等等。上述β-受体激动剂都存在共同的特征结构，即苯乙醇胺。目前已报到的文献中，对β-受体激动剂的检测方法有酶联免疫法、胶体金免疫法，免疫学方法针对性强，速度快，但是同时只能检测其中一种物质。液相色谱-质谱串联法，该方法灵敏度高，重复性好，但对仪器设备要求高，操作繁琐，不适合基层实验室操作。气相色谱-质谱串联法，该方法的分离效果没有液相色谱良好。液相色谱-紫外检测器法，该方法重复性良好，但是β-受体激动剂的紫外吸收不强，导致方法灵敏度受到限制，一般最低响应浓度为100ng/mL左右。液相色谱-荧光检测器法，该方法克服了紫外检测器灵敏度不高的缺点，最低响应浓度为10ng/mL左右。但是β-受体激动剂根据结构不同，并不是每种物质都有荧光性，如：克伦特罗、福莫特罗、苯乙醇胺A等物质荧光强度很弱甚至没有。所以荧光检测方法任然有很大的限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用离子液体催化合成的荧光强度高，反应位阻小，衍生速度快，易于得到的荧光探针的合成方法。本专利技术的另一个目的是提供一种用高荧光强度的荧光探针进行β受体激动剂检测的方法。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种高荧光强度的荧光探针的合成方法，以2,3-萘二胺、苯甲酰氯为反应物，以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐为催化剂制得。进一步地，其具体步骤为，A、按质量比分别称取反应物2,3-萘二胺7.8-8.2份，苯甲酰氯6.8-7.2份，催化剂1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐0.8-1.2份，均匀搅拌30min，得到混合溶液；B、用14.8-15.2份pH值为2的盐酸水溶液萃取上述混合溶液，3次；合并盐酸溶液;C、用8-12%氢氧化钠水溶液调节盐酸溶液pH值为10，此时会析出白色晶体状沉淀,过滤，用冷水多次洗涤滤饼;D、用45-55%的乙醇水溶液将滤饼重结晶，干燥，得到白色针状晶体，即为2-苯基萘并咪唑;E、取6.8-7.2份氯磺酸于圆底烧瓶中，在冰盐浴中充分冷却，加入步骤D制得的2-苯基萘并咪唑2.8-3.2份，充分搅拌，60℃加热溶解10min迅速倒入冰水中，静止，此时有针状沉淀析出，过滤，用冰水洗涤滤饼，干燥，得到黄色针状晶体1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑。上述的荧光探针进行检测的方法，包括如下步骤：步骤1：试剂准备，将0.2mol/L盐酸溶液，20g/L氯化钠溶液，甲醇按体积比1:1:1混合，得到样品提取液，该样品提取液可以有效的从动物源性制品中将目标物萃取到液相中，又不会溶解大量油脂等杂质影响实验结果；配制0.1mol/L碳酸钠水溶液，并用盐酸调节其pH值为9.5-10.1，得到衍生缓冲液，该缓冲液保证衍生试剂有效的与目标物中的仲胺基反应，不与酚类物质，醇类物质反应，让衍生试剂专一性较强；称取1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑0.2g溶于100mL丙酮中，得到衍生剂溶液；步骤2：称取5.00g样品于离心管中，加入25mL样品提取液，10000rpm匀浆1min，4℃，8000rpm离心5min，得到上清液和沉淀物，将该上清液转入鸡心瓶中，用5mL提取液洗涤该沉淀物，将洗涤后液体合并到盛放上清液的鸡心瓶中，50℃旋转蒸发至5mL以下，加入10mL正己烷，摇晃1min，静置分层，弃去上层正己烷层，将下层用水定容至5.00mL；步骤3：取上述样液1mL于具塞试管中，加入1mL衍生缓冲液，1mL衍生剂溶液，加塞，避光，90℃反应15min，加入0.05mL浓盐酸，摇匀后，过滤孔直径为0.45μm的滤膜；然后进行高效液相色谱仪测定；步骤4：以水为溶剂，配制七种β-受体激动剂个不同质量体积浓度的混合标准溶液，该七种β-受体激动剂系列混合标准溶液的质量体积浓度均为：1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、50.00ng/mL、100.00ng/mL；将七种β-受体激动剂系列混合标准溶液按步骤3进行衍生处理，于附带荧光检测器的高效液相色谱仪中测定；由该色谱图得到系列标准溶液中七种β-受体激动剂的荧光衍生物在该色谱条件下的出生时间和不同浓度的峰面积，并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘七种β-受体激动剂标准溶液的工作曲线；步骤5：根据步骤3测得的样品制备液的峰面积值，从步骤4绘制的系列标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的七种β-受体激动剂的含量，计算待测样品中七种β-受体激动剂的含量。进一步地，所述步骤3和步骤4中的色谱条件为，色谱柱：C184.6×250mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液40v+乙腈60；流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：20μL；激发波长：365nm，发射波长：405nm。本专利技术步骤2前处理方法操作简单，成本低。而且本专利技术所使用的检测器为液相色谱-荧光检测器。本专利技术创新点之一是该荧光探针，荧光强度高，合成简便，针对含有氨基化合物反应特异性强。本专利技术根据β-受体激动剂结构中含有仲胺基的特点，合成了针对仲胺基反应的荧光探针1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑，该衍生剂空间位阻小，反应活性高，荧光性强。在合成该衍生剂时区别于传统方法，创新性的采用离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐催化反应，在离子液体催化下，无需其他溶剂，反应绿色无污染，反应速度快，产率较高，容易净化分离得到纯品。所生成的荧光探针与β-受体激动剂衍生速度快，荧光强度高。衍生产物48h内，常温下稳定。与反相液相色谱流动相兼容性好。创新点之二是首次将荧光探针应用在β受体激动剂检测中。增加该类药物检测灵敏度，降低检测成本。用上述荧光探针测定动物源性制品中β-受体激动剂（包括：西马特罗、苯乙醇胺A、特布他林、福莫特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、克伦特罗等含有苯乙醇胺结构的其他β-受体激动剂）的方法成本低、灵敏度高。本专利技术建立一种灵敏度高（最低响应浓度为1ng/mL，方法检出限为0.3～0.4ng/g），回收率高（88.6%～91.4%），检测结果稳定（RSD%≤3.5%），操作简单，无需固相萃取净化，低成本的β-受体激动剂的检测方法。附图说明图1是采用本专利技术合成的荧光衍生试剂快速检测7种β-受体激动剂的色谱图。具体实施方式下面的实施例可以进一步说明本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。实施例1高荧光强度的荧光探针合成方法如下：按质量比分别称取反应物2,3-萘二胺8g，反应物苯甲酰氯7g，催化剂兼溶剂1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐1g于圆底烧瓶中，均匀搅拌30min，得到混合溶液。用15g的pH值为2的盐酸水溶液萃取上述混合溶液，3次。合并盐酸溶液。用10%氢氧化钠水溶液调节盐酸溶液pH值为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高荧光强度的荧光探针的合成方法，其特征在于：以2,3‑萘二胺、苯甲酰氯为反应物，以1‑丁基‑3‑甲基咪唑六氟磷酸盐为催化剂制得。

【技术特征摘要】
1.一种高荧光强度的荧光探针的合成方法，其特征在于：以2,3-萘二胺、苯甲酰氯为反应物，以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐为催化剂制得。2.根据权利要求1所述的高荧光强度的荧光探针的合成方法，其特征在于：具体步骤为，A、按质量比分别称取反应物2,3-萘二胺7.8-8.2份，苯甲酰氯6.8-7.2份，催化剂1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐0.8-1.2份，均匀搅拌30min，得到混合溶液；B、用14.8-15.2份pH值为2的盐酸水溶液萃取上述混合溶液，3次；合并盐酸溶液;C、用8-12%氢氧化钠水溶液调节盐酸溶液pH值为10，此时会析出白色晶体状沉淀,过滤，用冷水多次洗涤滤饼;D、用45-55%的乙醇水溶液将滤饼重结晶，干燥，得到白色针状晶体，即为2-苯基萘并咪唑;E、取6.8-7.2份氯磺酸于圆底烧瓶中，在冰盐浴中充分冷却，加入步骤D制得的2-苯基萘并咪唑2.8-3.2份，充分搅拌，60℃加热溶解10min迅速倒入冰水中，静止，此时有针状沉淀析出，过滤，用冰水洗涤滤饼，干燥，得到黄色针状晶体1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑。3.用权利要求1所述的荧光探针进行检测的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：试剂准备，将0.2mol/L盐酸溶液，20g/L氯化钠溶液，甲醇按体积比1:1:1混合，得到样品提取液，该样品提取液可以有效的从动物源性制品中将目标物萃取到液相中，又不会溶解大量油脂等杂质影响实验结果；配制0.1mol/L碳酸钠水溶液，并用盐酸调节其pH值为9.5-10.1，得到衍生缓冲液，该缓冲液保证衍生试剂有效的与目标物中的仲胺基反应，不与酚类物质，醇类物质反应，让衍生试剂专一性较强；称取1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑0.2g溶于100mL丙酮中，得到衍生剂溶液；步骤2：称取5.00g样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：周鑫魁，洪霞，钱滢文，高志莹，王杰斌，何海宁，
申请(专利权)人：甘肃省商业科技研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃,62