针对EPCR基因或EPCR蛋白的表达制备癌症诊断和治疗产品的方法技术

本发明专利技术公开了一种针对EPCR基因或EPCR蛋白的表达制备癌症诊断、治疗产品的方法及诊断试剂盒。具体地，所述癌症诊断产品为用实时荧光定量PCR诊断癌症的产品或免疫检测诊断的产品。所述实时荧光定量PCR诊断癌症的产品包括一对特异性针对EPCR的引物及探针。所述癌症治疗药物包括抑制EPCR基因表达和/或抑制EPCR蛋白活性的物质。本发明专利技术为癌症诊断和治疗提供了新的有效途径。

【技术实现步骤摘要】
针对EPCR基因或EPCR蛋白的表达制备癌症诊断和治疗产品的方法
本专利技术涉及针对EPCR基因或EPCR蛋白的表达制备癌症诊断和治疗产品的方法。
技术介绍
恶性肿瘤是严重危害人类健康的高发病率和高致死率的疾病。近年来许多实验及临床观察证实，凝血酶及其受体具有促进肿瘤生长和转移的作用。事实上，肿瘤细胞既有促凝活性又有纤溶活性，因为许多肿瘤细胞表面能够表达纤溶系统所需的全部蛋白，从而降解多种细胞外基质，有利于肿瘤周围胶原组织水解，促进肿瘤细胞向临近组织侵袭和转移。由此可见，恶性肿瘤发病的各个阶段均不同程度的涉及止凝血障碍和纤溶机制的异常。内皮细胞蛋白C受体(EndothelialcellproteinCreceptor，EPCR)是蛋白C抗凝途径新发现的成员，也是继血栓调节蛋白之后在肿瘤细胞表面发现的另一种与抗凝相关的蛋白。EPCR的基因如序列表中SEQIDNO.1号序列所示。EPCR的蛋白如序列表中sequenceIDNo.2号序列所示。已有的研究表明EPCR可通过与活化蛋白C(APC)结合激活蛋白酶活化受体(PAR-1)，促进细胞增殖及抑制凋亡，EPCR在此过程中起着关键的介导作用；新近发现，APC通过与细胞表面的EPCR及PAR-1结合可呈浓度依赖型的提高乳腺癌细胞株的迁移性和趋化性，提示肿瘤细胞和组织EPCR的过度表达有利于其增殖，抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤的进展和转移。因此，EPCR除了参与抗凝和调节炎症反应外，还参与抑制细胞凋亡与肿瘤的耐药和转移等诸多病理过程。人EPCR的cDNA含1302个碱基，开放阅读框含有714个氨基酸，编码238个氨基酸，在加工过程中去除17个氨基酸信号肽，即成为221个氨基酸组成的成熟蛋白。EPCR是相对分子质量为46KD的I型跨膜蛋白，其由胞外区、跨膜区和一个短的高度保守的胞浆尾组成。细胞膜上的EPCR属于结合型EPCR，另外血浆中还存在可溶性的EPCR(rEPCR)，同样具有与蛋白C及APC结合能力。新近研究证实，EPCR在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤等多种肿瘤细胞及白血病细胞中均具有表达，尤其是在恶性实体瘤当中。EPCR基因高表达是多种肿瘤细胞的重要特征，提示EPCR可作为癌症诊断的肿瘤标记物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种针对EPCR基因或EPCR蛋白的表达制备癌症诊断和治疗产品的方法。为解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现：一种针对EPCR基因或EPCR蛋白的表达制备癌症诊断产品的方法。进一步地：所述癌症诊断产品为用实时荧光定量PCR诊断癌症的产品或免疫检测诊断的产品。所述实时荧光定量PCR诊断癌症的产品包括一对特异性针对EPCR的引物及探针。所述引物及探针为如下序列：EPCR-F：TCACCTTCACCCTGCAGCA，对应序列表中的SEQIDNO.3号序列，EPCR-R：TTGTTTGGCTCCCTTTCGTG，对应序列表中的SEQIDNO.4号序列，探针序列：GCTCAATGCCTACAACCGCACTCGG，对应序列表中的SEQIDNO.5号序列。所述用于免疫检测癌症诊断的产品包括与EPCR蛋白特异性结合的抗体。优选地，所诉抗体的基因序列包括如序列表中的SEQIDNO.6所示的重链可变区序列以及如序列表中的SEQIDNO.7所示的轻链可变区序列。一种用于癌症诊断的试剂盒，所述试剂盒包括特异性针对EPCR基因的引物及探针和/或特异性结合EPCR蛋白的抗体。一种针对EPCR基因或EPCR蛋白的表达制备癌症治疗药物的方法。进一步地：所述癌症治疗药物包括抑制EPCR基因表达和/或抑制EPCR蛋白活性的物质。所述癌症治疗药物包括通过RNA干涉抑制EPCR基因表达的核糖核酸，和/或抑制EPCR蛋白活性的蛋白质。所述癌症包括：肺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾瘤、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤。一种针对EPCR基因或EPCR蛋白的表达筛选癌症治疗药物的方法，以EPCR基因作为靶点，筛选抗肿瘤药物。本专利技术提供了针对EPCR基因及表达产物制备癌症诊断试剂的方法或试剂盒。根据本专利技术，EPCR基因及其表达产物还可作为癌症治疗药物的靶基因，可针对EPCR基因或EPCR蛋白的表达制备癌症治疗药物。从而，本专利技术提供了有效诊断和治疗癌症的新途径。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本专利技术的范围及其应用。未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件中所述的方法进行。实施例1实时定量PCR检测EPCR基因的差异表达(1)引物及探针设计采用PrimerPremier5.0软件对EPCR基因的引物及探针进行优化设计如下：EPCR-F：TCACCTTCACCCTGCAGCA(对应序列表中的SEQIDNO.3号序列)，EPCR-R：TTGTTTGGCTCCCTTTCGTG(对应序列表中的SEQIDNO.4号序列)，探针序列：GCTCAATGCCTACAACCGCACTCGG(对应序列表中的SEQIDNO.5号序列)。(2)组织及细胞总RNA提取1)采用TRIzolReagent(Invitrogen)试剂抽提RNA，具体操作如下：将相关组织从液氮中取出，在研钵中研磨成粉末，转移至装有适量体积(1mL)TRIzol试剂的离心管中，充分匀浆；室温放置5分钟，按比例向离心管中加入氯仿(200μL/1mlTRIzol)，迅速剧烈振荡15秒，室温静置10分钟，4℃，12000rpm条件下离心15分钟；小心吸取上清至新的无RNA酶的EP管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10分钟；4℃，12000rpm条件下离心10分钟后，小心吸去上清，加入2/5体积70％乙醇，轻轻混匀洗涤RNA；4℃，12000rpm条件下离心15分钟；弃上清，尽可能除尽残留乙醇，沉淀室温干燥5–10min；加入适量DEPC水充分溶解沉淀，采用无RNA酶的DNA酶I去除基因组DNA的污染；酶标仪测定RNA浓度及纯度OD260/280(1.8–2.0)；凝胶电泳观察有无降解，－80℃保存。2)细胞株RNA抽提，取对数生长期的细胞，吸取培养液，根据培养皿的面积加入相应量的TRIzol试剂(1mLTRIzol/10cm2)裂解细胞，吹打几次，将裂解下来的细胞收集至无RNA酶的EP管中，其余按照上述步骤完成氯仿—异丙醇法分离纯化RNA。(3)cDNA制备取2μg总RNA，依次加入Oligo(dT)1μL和DEPC水至20μL体系，70℃变性5min，迅速置冰上；然后加入5×逆转录缓冲液8μL、dNTP(10nmol/L)1μL、RNasin0.5μL、M-MLV1μL及DEPC水9.5μL，37℃1h，95℃5min后置冰上，-20℃保存备用。(4)实时定量PCR反应采用ABI7500实时荧光定量PCR仪，PCR反应条件设置为：50℃2分钟，1个循环；95℃15分钟，1个循环；94℃15秒→55℃,45秒(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行；设探针检测模式设置为：ReporterDye：FAM，QuencherDye：NONE，PassiveReference：NONE。(5)结果分析荧光本底信号和阈本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对EPCR基因或EPCR蛋白的表达制备癌症诊断产品的方法。

【技术特征摘要】
1.一种针对EPCR基因或EPCR蛋白的表达制备癌症诊断产品的方法。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症诊断产品为用实时荧光定量PCR诊断癌症的产品或免疫检测诊断的产品。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述实时荧光定量PCR诊断癌症的产品包括一对特异性针对EPCR的引物及探针。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述引物及探针为如下序列：EPCR-F：TCACCTTCACCCTGCAGCA，对应序列表中的SEQIDNO.3号序列，EPCR-R：TTGTTTGGCTCCCTTTCGTG，对应序列表中的SEQIDNO.4号序列)，探针序列：GCTCAATGCCTACAACCGCACTCGG，对应序列表中的SEQIDNO.5号序列。5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用于免疫检测癌症诊断的产品包括与EPCR蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖生赟，陈建东，李川，孙悦，
申请(专利权)人：深圳市亿立方生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44