一株高产脂肪酶的假单胞菌及其发酵产酶方法技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，具体涉及一株高产脂肪酶的假单胞菌及其发酵产酶方法。所述假单胞菌具体为假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD‑14，菌株保藏号为CGMCC No.14414。假单胞菌LD‑14发酵生产脂肪酶的发酵液酶活达到25000U/mL至26000U/mL；所产脂肪酶最适pH范围为8.5‑10.0，最适作用温度范围为30℃‑40℃，在20℃保温1d后剩余酶活为80％，具有显著的耐低温性和耐碱性，可广泛应用于工业生产。

A strain of Pseudomonas with high lipase and its fermentation production method

The invention belongs to the field of microbial technology, in particular to a Pseudomonas with high yield of lipase and a method of fermentation producing enzyme. The Pseudomonas aeruginosa (specific for Pseudomonas sp. LD) 14 strains, preservation number is CGMCC No.14414. To achieve 25000U/mL 26000U/mL enzyme activity of fermented broth of Pseudomonas sp. LD lipase production 14 fermentation; lipase of the optimum pH range of 8.5 10, the optimum temperature range of 30 DEG C 40 DEG, 20 DEG C in 1D residual activity was 80%, with significant low temperature resistance and alkali resistance it can be widely used in industrial production.

【技术实现步骤摘要】
一株高产脂肪酶的假单胞菌及其发酵产酶方法
：本专利技术属于微生物
，具体涉及一株高产脂肪酶的假单胞菌及其发酵产酶方法。
技术介绍
：脂肪酶(Triacylglycerolacylhydrolases,EC3.1.1.3)是能在油水界面上水解甘油三酯的一类酶的总称，其能水解三酰甘油酯为脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯。脂肪酶主要来源于植物、动物、微生物，其中微生物脂肪酶广泛存在于细菌、酵母和霉菌中，具有种类多、周期短、繁殖快、易发生遗传变异的特点，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用pH和底物特异性，其可以在不需要辅酶的条件下催化酯类化合物的水解、醇解、酸解、酯交换及合成等，催化条件温和、能耗低、副产物少，具有高效、高选择性、环境友好等特点，改变了传统的酯化或转酯化反应所需要的高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件。微生物脂肪酶适合于工业化大生产，可生产出高纯度制品，在基础理论研究和实际应用中都具有重大价值。目前，脂肪酶的生产方法主要包括提取法和微生物发酵法，其中，微生物发酵法以其较高的得率、较低的成本以及来源广泛的菌种资源而成为脂肪酶生产的首选方法。脂肪酶及其改性制剂由于其本身酶学性质的特殊性，已在食品与营养品加工工业、油脂化工工业、日用化工产业、医药与农业、生物活性剂合成等许多领域得到广泛应用。其广泛的应用范围，丰富的资源，在工业化生产中显示出越来越重要的地位。而现有技术中的脂肪酶最适反应温度一般在40℃或更高，在30℃以下失活严重，因此，受酶活及酶适用条件的制约，目前现有技术脂肪合酶仍不能满足工业生产的需求，所以选育一株高产脂肪酶的假单胞菌菌株，其发酵产品具有良好的耐碱和耐低温性，生产成本低廉，对大规模推进各行业的机械化具有重大意义。
技术实现思路
：为了解决上述问题，本专利技术将提供一株高产脂肪酶的假单胞菌及其发酵产酶方法与脂肪酶，在确保假单胞菌发酵高产脂肪酶稳定性的同时，显著提高脂肪酶良好的耐碱和耐低温性。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现目的：一株高产脂肪酶的假单胞菌，所述菌株为假单胞菌(Pseudomonassp.)LD-14，菌株保藏号为CGMCCNo.14414。所述假单胞菌(Pseudomonassp.)LD-14是通过对假单胞菌原始菌株进行常温常压等离子体诱变得到的，所述的假单胞菌LD-14已于2017年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.14414，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。所述假单胞菌LD-14的菌落形态特征如下：圆形、乳白色、周边整齐、呈凸透镜状、表面光滑、有色泽、不透明、有臭味。本专利技术的另一目的在于提供上述假单胞菌LD-14的发酵产酶方法如下：发酵罐培养：将种子液按照接种量6％(v/v)的比例接入发酵罐培养基，恒温35℃，转速200r/min，设置通风量：0至5h为0.25vvm、5h至20h为0.5vvm、20h至发酵结束为1.0vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液pH值为6.8，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为150h，得到最终发酵液；脂肪酶的发酵液酶活可达：25000U/mL至26000U/mL；将最终发酵液通过提取与精制方法，获得脂肪酶成品液体酶制剂。进一步地，所述种子液的制备方法如下：将二级种子液按照接种量6％(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温35℃，转速200r/min条件下培养12-15h；进一步地，所述二级种子液的制备方法如下：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温35℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；进一步地，所述一级种子的制备方法如下：挑取一环假单胞菌LD-14接种于固体斜面培养基，35℃下恒温培养36h，得一级种子；进一步地，所述脂肪酶的提取与精制方法如下：(1)将最终发酵液加入1～5％珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；(2)用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；(3)在上述浓缩液中加入20％(m/v)的稳定剂、0.45％(m/v)的防腐剂，调节pH8.5，然后进行过滤除菌，即得到脂肪酶成品液体酶制剂。优选地，所述稳定剂为甘油，所述防腐剂为质量比为1：2的山梨酸钾和苯甲酸钠。所述固体斜面培养基(g/L)：蛋白胨12，酵母膏6，琼脂15，氯化钠1，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20min；所述种子培养基(g/L)：麦芽糖浆40，蛋白胨5，酵母膏5，氯化钠0.8，硫酸镁0.5，氯化钙0.1，磷酸氢二钠0.5，余量为水，pH6.8，121℃灭菌20min；所述种子罐培养基(g/L)：葡萄糖80，酵母膏15，玉米浆5，硫酸铵1，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.5，氯化钙0.1，pH6.8，121-123℃灭菌30min；所述发酵罐培养基(g/L)：麦芽糖180，蛋白胨10，酵母膏5，硫酸铵1.5，硫酸镁0.5，玉米油20，氯化钙0.1，磷酸氢二钾0.3，pH6.8，121-123℃灭菌30min；所述补料培养基(g/L)：麦芽糖浆450，KH2PO45，玉米浆7，玉米油40，氯化钙5，pH4.0，121-123℃灭菌30min。本专利技术还提供一种由上述假单胞菌LD-14发酵生产的脂肪酶，所述脂肪酶具有如下特性：(1)温度：最适作用温度范围为30℃-40℃；(2)pH：最适pH范围为8.5-10.0；(3)耐低温特性：在20℃保温1d后剩余酶活为80％。有益效果：本专利技术通过对假单胞菌原始菌株LA-32进行常温常压等离子体诱变选育了一株高产脂肪酶的突变菌株LD-14，并对假单胞菌LD-14发酵过程进行补料条件优化使其酶活达到25000U/mL至26000U/mL之间，而假单胞菌原始菌株通过液态发酵后最高酶活为19500U/mL。由此可以看出，假单胞菌LD-14显著高于假单胞菌原始菌株的酶活。本专利技术菌株的发酵方法中培养基成分均来源于成本较低的原料，且在提高发酵产能、提升生产效率的同时，大大减少发酵成本，对生产具有极大帮助。假单胞菌LD-14发酵得到的脂肪酶最适pH范围为8.5-10.0，最适作用温度范围为30℃-40℃，在20℃保温1d后剩余酶活为80％，具有显著的耐低温性和耐碱性，可广泛应用于工业生产中，显著地拓展了脂肪酶的工业应用范围，提高了脂肪酶的应用价值。附图说明：图1：不同pH下的相对酶活；图2：不同温度下的相对酶活；图3：20℃下保温1d后的相对酶活。具体实施方式：下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。实施例1假单胞菌LD-14的诱变选育取两株出发菌株LA-32的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体分散，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为107-108个/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株高产脂肪酶的假单胞菌，其特征在于，所述菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD‑14，菌株保藏号为CGMCC No.14414。

【技术特征摘要】
1.一株高产脂肪酶的假单胞菌，其特征在于，所述菌株为假单胞菌(Pseudomonassp.)LD-14，菌株保藏号为CGMCCNo.14414。2.权利要求1所述假单胞菌的应用。3.权利要求2所述的假单胞菌的应用，其特征在于，假单胞菌LD-14应用于脂肪酶制备的发酵方法如下：将种子液按照接种量6％的比例接入发酵罐培养基，恒温35℃，转速200r/min，设置通风量：0至5h为0.25vvm、5h至20h为0.5vvm、20h至发酵结束为1.0vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液pH值为6.8，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为150h。4.权利要求3所述的假单胞菌的应用，其特征在于，所述发酵罐培养基为：麦芽糖180g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，硫酸铵1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，玉米油20g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，pH6.8，121-123℃灭菌30min；所述补料培养基为：麦芽糖浆450g/L，KH2PO45g/L，玉米浆7g/L，玉米油40g/L，氯化钙5g/L，pH4.0，121-123℃灭菌30min。5.权利要求3所述的假单胞菌的应用，其特征在于，所述种子液的制备方法如下：将二级种子液按照接种量6％的比例接入种子罐培养基中，恒温35℃，转速200r/min条件下培养12-15h；所述二级种子液的制备方法如下：将一级种子取一环接入种...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兴吉，郭庆文，刘文龙，曹世源，佟新伟，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37