一种快速分析蜂花粉中脂类成分的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速分析蜂花粉中脂类成分的方法。利用超高效反相液相色谱与四级杆‑静电场轨道阱高分辨质谱联用技术(UPLC‑Q‑Exactive Orbitrap MS)，并利用正负离子监测模式、全扫描及自动触发二级质谱扫描的功能，准确实现不同植物来源蜂花粉中脂类物质的精确定量，为蜂花粉产地溯源、真实性判别、掺杂打假以及蜂花粉的功能营养学研究提供依据。该技术分辨率高，定性准确，克服了以往技术在成分鉴别中准确度和可靠性低的问题，是一种脂质组学分析的新型高效技术。

A rapid method for analysis of lipid components in bee pollen

The present invention relates to a rapid method for analyzing lipid components in bee pollen. The use of ultra efficient reversed-phase liquid chromatography with four quadrupole Orbitrap high resolution mass spectrometry (UPLC Q Exactive Orbitrap MS), and the use of positive and negative ion monitoring mode, full scan and automatic trigger two MS scan function, to achieve accurate precise and quantitative lipid substances of different plant sources of bee pollen in, provide the basis for traceability, bee pollen origin authenticity identification, and the function of bee pollen doping crackdown nutrition research. The technique has high resolution, qualitative and accurate, and overcomes the problems of low accuracy and low reliability in component identification. It is a new and efficient technique for lipid omics analysis.

【技术实现步骤摘要】
一种快速分析蜂花粉中脂类成分的方法
本专利技术属于化学分析领域，具体涉及一种快速分析蜂花粉中脂类成分的方法。
技术介绍
脂类，又称脂质，这是一类不溶于水而易溶于脂肪溶剂(醇、醚、氯仿、苯)等非极性有机溶剂，由脂肪酸与醇作用脱水缩合生成的酯及其衍生物统称为脂类，其中包括脂肪、蜡、类固醇、脂溶性维生素(如维生素A，D，E和K)、单酸甘油酯、二酸甘油酯、磷脂等。它的主要生理功能包括储存能量、构成细胞膜以及膜的讯息传导等。如今，脂类已经被用于美容和食品工业。脂质根据其双亲性的特质(兼具亲水性与疏水性)可以概分为八类：脂肪酸、甘油酯、甘油磷脂、鞘脂(神经脂质)、糖脂质、聚酮类(由酮乙基次单元聚合而成)、固醇脂类，以及孕烯醇酮脂类(由异戊二烯次单元缩合聚合而成)。蜂花粉是指蜜蜂采蜜时带回的花粉团，在蜂巢内经过储藏和发酵后形成的不规则扁圆形的团状物。蜂花粉中含有丰富的营养物质和生物学活性物质，具有保护心血管系统、促进机体免疫力、清除自由基、调节肠道功能和治疗前列腺疾病等。蜂花粉含有蛋白质、必需氨基酸、多糖、维生素、不饱和脂肪酸、多酚类和黄酮类等活性物质，越来越多地被应用于食品和医疗工业。蜂花粉中的脂类成分在其营养成分中占据重要地位，并且不同种类的蜂花粉中脂类成分的组成和含量也是不同的。近些年，蜂花粉中的脂类成分越来越受到国内外研究人员的广泛关注。其中，大多数实验集中于花粉中脂肪酸的研究。脂肪酸的种类繁多，常见的脂肪酸有丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四酸、油酸、棕榈酸、芥子酸、亚油酸、花生四稀酸和神经酸等。目前，已在花粉中发现了亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等多不饱和脂肪酸。除脂肪酸外，不同种类的花粉中所含的脂种类及含量也是不同的，蜂花粉中除脂肪酸外的其他脂类成分报道并不充分。现有蜂花粉中脂质组分的常用检测方法包括薄层层析法，气相色谱法，气相色谱串联质谱法或反相液相色谱串联质谱技术(利用的是大气压化学电离源)。但现有方法分辨率和灵敏度低，不可以消除干扰，无法实现可靠的代谢物结构识别，完成不了大规模脂类组学样品分析。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种蜂花粉中脂类成分的检测方法，其利用超高效反相液相色谱与四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术(UPLC-Q-ExactiveOrbitrapMS)，并利用正负离子监测模式、全扫描及自动触发二级质谱扫描的功能，准确实现不同植物来源蜂花粉中脂类物质的精确定量，为蜂花粉产地溯源、真实性判别、掺杂打假以及蜂花粉的功能营养学研究提供依据。该技术分辨率高，定性准确，克服了以往技术在成分鉴别中准确度和可靠性低的问题，是一种脂质组学分析的新型高效技术。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种快速分析蜂花粉中脂类成分的方法，包括如下步骤：(1)样品预处理称取蜂花粉，研磨粉碎后加入花粉脂质提取液，涡旋、静置后离心，静置，分层后取下层有机相；向有机相加入去离子水，萃取涡旋，静置，抽提后离心，取下层有机相，氮气吹干，得到透明薄膜，重溶于花粉脂质提取液，待测；(2)利用UPLC-Q-ExactiveOrbitrapMS技术对样品进行定性和定量分析；(3)利用软件Lipidsearch4.0(ThermoFisher,CA)进行数据分析，基于一级母离子(MS1)和二级碎片离子(MS2)信息进行数据库检索，自动匹配保留时间，准确质量数(MS1masserrorof<5ppm，MS2masserrorof<8ppm)，鉴定样品中的脂质成分；再根据标准溶液浓度曲线定量分析样品中脂质成分的含量。步骤(1)中，所述花粉脂质提取液为氯仿与甲醇按体积比2:1的混合溶液；并按料液比1:4-8加入。步骤(2)中，所述超高效反相液相色谱为Agilent1290UPLC超高效液相色谱仪。所述检测条件为：流动相包括：A组分乙腈和水(60:40，按体积百分比计，含10mM乙酸胺)，B组分异丙醇和乙腈(90:10，按体积百分比计，含10mM乙酸胺)；洗脱方式：梯度洗脱；所述梯度洗脱方式为：0-20min，A组分由63％降至2％，B组分由37％增至98％(按体积百分比计)；20-28min，2％A，98％B(按体积百分比计)；28-28.1min，A组分由2％降升至63％，B组分由98％降至37％(按体积百分比计)；28.1-35min，63％A，37％B(按体积百分比计)。所述洗脱速度为150-300μL/min。质谱条件：采集模式：正、负离子采集模式；离子源：电喷雾离子源(ESI)；所述离子源温度：200-350℃；毛细管温度：200-350℃；喷雾电压：2-3.0kV；鞘气流速：30-35Arb；辅助气流速：0-10Arb。扫描方式：数据依赖型二级扫描；采集范围：正离子模式下240-2,000m/z，负离子模式下200-2,000m/z；碰撞能量：10-50eV。色谱柱：反相色谱柱。进样量：1-2μL。本专利技术所述分析方法中涉及的脂类成分包括：神经酰胺、溶血性卵磷脂、甘油三酯、甘油二酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、脂肪酸。采用本专利技术所述分析方法得到的9类脂类成分的检出限(LOD)，定量限(LOQ)，线性范围和回归方程如表1所示。表19类脂质标品的检出限(LOD)，定量限(LOQ)，线性范围和回归方程本专利技术的分析方法分辨率和灵敏度高，可以消除干扰，首次实现蜂花粉中脂质成分的组学分析。附图说明图1为茶花蜂花粉的总离子流(TIC)图(a为正离子模式，b为负离子模式)。图2为荷花蜂花粉的总离子流(TIC)图(a为正离子模式，b为负离子模式)。图3为油菜蜂花粉的总离子流(TIC)图(a为正离子模式，b为负离子模式)。具体实施方式以下实施例中样品前处理过程所用耗材均为玻璃材质，以防产生塑料污染。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1：茶花蜂花粉中脂质组分的UPLC-Q-ExactiveOrbitrapMS检测方法，其方法如下：(1)样品前处理：①称取5-10g茶花蜂花粉，研磨粉碎后加入一定量的花粉脂质提取液，涡旋、静置后离心，重复三次，最后一次离心静置，待溶液分层后取下层有机相置于新管中；②加入去离子水，对花粉有机层进行二次萃取涡旋，静置，重复三次，充分抽提后，离心，取出下层有机相于新管中，在氮气的保护下吹干有机溶剂至透明薄膜状，吹干后重溶于花粉脂质提取液，待测；(2)利用UPLC-Q-ExactiveOrbitrapMS技术进行定性和定量分析：用氯仿:甲醇(2:1，V/V)将样品稀释400倍和100倍分别于正、负离子模式下进行检测，指定液相色谱条件如下：液相色谱系统：Agilent1290UPLC超高效液相色谱仪；色谱柱：正离子模式下使用CORTECSC18100×2.1mm2.7μm色谱柱(Waters)，负离子模式下使用XSelectCSHC18100×2.1mm2.5μm色谱柱(Waters)；柱温：45℃；进样量：1μL；流速为：0.25mL/min；流动相：A相：乙腈和水(60:40V/V,含10mM乙酸胺本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速分析蜂花粉中脂类成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品预处理称取蜂花粉，研磨粉碎后加入花粉脂质提取液，涡旋、静置后离心，静置，分层后取下层有机相；向有机相加入去离子水，萃取涡旋，静置，抽提后离心，取下层有机相，氮气吹干，得到透明薄膜，重溶于花粉脂质提取液，待测；(2)利用UPLC‑Q‑Exactive Orbitrap MS技术对样品进行定性和定量分析；(3)利用软件Lipidsearch 4.0进行数据分析，基于一级母离子和二级碎片离子信息进行数据库检索，自动匹配保留时间，准确质量数，鉴定样品中的脂质成分；再根据标准溶液浓度曲线定量分析样品中脂质成分的含量。

【技术特征摘要】
1.一种快速分析蜂花粉中脂类成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品预处理称取蜂花粉，研磨粉碎后加入花粉脂质提取液，涡旋、静置后离心，静置，分层后取下层有机相；向有机相加入去离子水，萃取涡旋，静置，抽提后离心，取下层有机相，氮气吹干，得到透明薄膜，重溶于花粉脂质提取液，待测；(2)利用UPLC-Q-ExactiveOrbitrapMS技术对样品进行定性和定量分析；(3)利用软件Lipidsearch4.0进行数据分析，基于一级母离子和二级碎片离子信息进行数据库检索，自动匹配保留时间，准确质量数，鉴定样品中的脂质成分；再根据标准溶液浓度曲线定量分析样品中脂质成分的含量。2.根据权利要求1所述的快速分析蜂花粉中脂类成分的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述花粉脂质提取液为氯仿与甲醇按体积比2:1的混合溶液；并按料液比1:4-8加入。3.根据权利要求1或2所述的快速分析蜂花粉中脂类成分的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超高效反相液相色谱的流动相包括：A组分乙腈和水，按体积百分比计60:40，含10mM乙酸胺，B组分异丙醇和乙腈，按体积百分比计90:10，含10mM乙酸胺。4.根据权利要求1或2所述的快速分析蜂花粉中脂类成分的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超高效反相液相色谱的洗脱方式：梯度洗脱；所述梯度洗脱为：0-20...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凯，李强强，吴黎明，薛晓锋，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11