一种淡水水体中D型氨基酸的提取与测定方法技术

本发明专利技术涉及一种氨基酸的提取和测定方法，具体公开了一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法。该方法包括以下步骤：S1.取样；S2.采用微波辅助气相酸水解的方法进行处理；S3.将N‑异丁酰‑D‑半胱氨酸和邻苯二甲醛溶解到甲醇溶液中，使用缓冲溶液稀释得邻苯二甲醛衍生剂；S4.取待测样品，依次加入邻苯二甲醛衍生剂和缓冲溶液，涡旋器混匀，室温下放置进行衍生反应；S5.采用高效液相色谱‑荧光检测器进行测定。本发明专利技术采用微波辅助气相酸水解的前处理方法，实现了对淡水水体中D型氨基酸的提取与测定，具有操作简便、回收率高、方法精密度高等优点。

A method for extraction and determination of D amino acids in fresh water

The invention relates to a method for extracting and measuring amino acids, and specifically discloses a method for extracting and measuring D type amino acids in fresh water. The method comprises the following steps: S1. processing phase sampling; acid hydrolysis method of S2. by microwave assisted gas; S3. N isobutyryl D cysteine and phthalate two formaldehyde dissolved in methanol solution, the use of buffer solution diluted to two formaldehyde benzene derivative agent; S4. test samples, respectively join the adjacent benzene two formaldehyde derivative agent and buffer solution, the swirler mixing, room temperature derivatization reaction; S5. by high performance liquid chromatography fluorescence detector for determination of. The invention adopts the pretreatment method of microwave assisted gas phase acid hydrolysis, realizes the extraction and determination of D type amino acids in fresh water, and has the advantages of simple operation, high recovery rate and high precision of the method.

【技术实现步骤摘要】
一种淡水水体中D型氨基酸的提取与测定方法
本专利技术涉及一种氨基酸的提取和测定方法，具体涉及一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法。
技术介绍
氨基酸是含有氨基和羧基的一类重要有机化合物，它是水体与沉积物有机质的重要组成部分，在水生生态系统营养物质(碳、氮、硫、磷等)的环境地球化学循环过程中发挥重要作用。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，自然界中组成蛋白质的α-氨基酸共有20多种，除甘氨酸外，所有α-氨基酸中的α碳原子均是手性碳，因此氨基酸具有D型与L型两种空间构型。生物体内的蛋白质几乎都是由L型氨基酸所构成的，D型氨基酸含量极少。D型氨基酸来源极其特殊，仅存在于一些细菌和植物的细胞壁中。细菌在生长和代谢过程中产生D型氨基酸(包括D型天冬氨酸、D型丙氨酸、D型丝氨酸和D型谷氨酸)，D型氨基酸不易发生降解，能够在环境中长期保存并积累，可用于辨识有机质来源和迁移转化过程。近几十年来，我国河流湖泊水体富营养化问题日趋严重，淡水生态系统中有机质含量极高。淡水水体有机质在物理化学特性与结构组成、来源与迁移转化过程等明显不同于海水。海水环境中有机质来源相对稳定单一，主要是生物的生命活动产生，有机质含量较低。而淡水水体有机质来源极其复杂，有内源与外源两种，内源过程主要来自于水生植物和底栖动物分解、微生物生命活动、细菌分解代谢、沉积物释放等，外源过程则主要来自于流域生产生活过程(如工业污水排放、矿山废水排放、农药化肥的使用)中输入的有机物质，伴随着氮磷等营养物质的输入。水体发生富营养化后，生物活动活跃，有机质含量剧烈增加和聚集，加上氮磷负荷的增加和水体物理化学条件的变化，改变了水生态系统中有机质的循环规律，导致有机质的组成与结构、来源、降解、沉积速率和环境效应等方面均发生明显的变化。淡水湖泊水体中D型氨基酸的分离提取与测定技术可为淡水生态系统中有机质的复杂来源与过程辨识提供技术支持，有助于阐述水体富营养化过程与成因，为富营养化治理提供科技支撑。目前对于淡水水体中D型氨基酸的提取与测定方法尚未见相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法。该方法实现了对淡水中的D型氨基酸(包括D型天冬氨酸、D型丙氨酸、D型丝氨酸和D型谷氨酸)分离提取和测定，具有测定速度快、回收率高、方法精密度高等优点。本专利技术的技术方案为：一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法，包括以下步骤：S1.取样水体样品过0.45μm滤膜去除杂质，-4℃条件下，黑暗密封保存；S2.水样预处理采用微波辅助气相酸水解的方法进行：取待测水样，加入抗坏血酸溶液以防止待测溶液中氨基酸发生氧化，加入盐酸溶液，混匀后放入微波消解仪，进行消解得水解液；将所述水解液冷却至室温后，用碱液中和至中性，得待测样品，密封待测；S3.衍生剂制备将N-异丁酰-D-半胱氨酸和邻苯二甲醛(OPA)溶解到甲醇溶液中，使用缓冲溶液稀释，使得N-异丁酰-D-半胱氨酸的浓度为5-6g/L和邻苯二甲醛的浓度为2-2.5g/L，所得溶液为邻苯二甲醛衍生剂(OPA衍生剂)，4℃密封保存；S4.衍生反应取待测样品，依次加入邻苯二甲醛衍生剂和缓冲溶液，涡旋器混匀，室温下放置，保证氨基酸与邻苯二甲醛充分发生衍生反应；S5.仪器测定采用高效液相色谱-荧光检测器进行测定；采用反相C18高效液相色谱柱对D型和L型氨基酸进行分离；其中，色谱柱为：LiChrospher100RP-18色谱柱；流动相的组成为：流动相A采用35-45mmolL-1磷酸二氢钾缓冲溶液，pH＝12；流动相B采用甲醇：乙腈＝13:1(体积比)；采用梯度洗脱。进一步地，所述水样预处理的具体步骤为：取1ml待测水样，加入100-120μl12mmolL-1抗坏血酸溶液以防止待测溶液中氨基酸发生氧化，加入0.5-0.6ml6molL-1盐酸溶液，混匀后转移至消解罐中，将消解罐放入微波消解反应容器中，向微波消解反应容器加入25ml6molL-1盐酸溶液后密封，抽真空，充入氮气，进行消解。进一步地，所述微波消解仪输出功率为600W，自动升温程序为：2-4min内升温至150℃，150℃保持30-35min，样品冷却至80℃后，程序结束。更进一步地，所述微波消解仪输出功率为600W，自动升温程序为：3min内升温至150℃，150℃保持32.5min，样品冷却至80℃后，程序结束。进一步地，所述碱液为NaOH溶液和KOH溶液中的一种或两种的混合，进一步优选为NaOH溶液。进一步地，所述步骤S3和步骤S4的缓冲溶液为pH值为9.5，浓度为0.5molL-1硼酸缓冲溶液。进一步地，所述衍生剂制备的具体过程为：将0.05-0.06gN-异丁酰-D-半胱氨酸和0.02-0.03g邻苯二甲醛溶解到1ml甲醇溶液中，使用pH值为9.5，浓度为0.5molL-1硼酸缓冲溶液稀释至10ml，所得溶液为邻苯二甲醛衍生剂。采用邻苯二甲醛作为柱前衍生剂测定D型氨基酸含量。在含有巯基的N-异丁酰-D-半胱氨酸的存在下，邻苯二甲醛衍生剂能够与氨基酸迅速发生衍生反应，衍生产物经高相液相色谱分离后即可进行高灵敏度荧光检测，该方法具有操作简便、反应速率快、试剂不干扰测定等优点。进一步地，所述衍生反应为：取待测样品，依次加入邻苯二甲醛衍生剂和pH值为9.5，浓度为0.5molL-1硼酸缓冲溶液，涡旋器混匀，室温下放置20-30min，保证氨基酸与邻苯二甲醛充分发生衍生反应；其中，待测样品，邻苯二甲醛衍生剂和pH值为9.5，浓度为0.5molL-1硼酸缓冲溶液的体积比为：1：(1-1.2)：(1-1.2)。更进一步地，所述衍生反应的具体步骤为：准确吸取100μl待测样品置于样品瓶，依次加入100μl邻苯二甲醛衍生剂、100μlpH值为9.5，浓度为0.5molL-1硼酸缓冲溶液，涡旋器混匀，室温下放置20-30min，保证氨基酸与邻苯二甲醛充分发生衍生反应。衍生后，采用高效液相色谱-荧光检测器进行测定。进一步地，所述高效液相色谱-荧光检测器的分离检测条件为：流动相A采用40mmolL-1磷酸二氢钾缓冲溶液，pH＝12，过0.22μm滤膜；流动相B采用甲醇：乙腈＝13:1(体积比)，过0.22μm滤膜。进一步地，所述高效液相色谱-荧光检测器的分离检测的梯度洗脱程序如下：流速为0.8mlmin-1，柱温30℃，配备自动进样器，进样量为10-30μl，检测器为荧光检测器，激发波长为350nm，发射波长为420nm。进一步地，所述淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法还包括方法精密度和可靠性考察，即步骤S6.方法精密度和加标回收率：在样品中分别添加3个浓度水平的四种D型氨基酸标准溶液，每一浓度水平3个重复，进行步骤S1-S5，以考察方法精密度和加标回收率。本专利技术采用气相酸水解，水体样品经消解后仅稀释了10倍，充分保证氨基酸能够被仪器检出。另外，由于淡水里的D型氨基酸的含量与干扰成分的复杂性，酸量加大可以使水体中的D型氨基酸充分水解，水解更彻底，测量结果准确；同时，衍生反应受水体样品与衍生剂的配比和衍生剂浓度影响较大，本专利技术通过控制衍生剂的量和浓度，保证了D型氨基酸与衍生剂充分发生衍生反应，进一步有利于结果的准确测定。本专利技术仪器测定时的洗脱时间长，洗脱程序精细，经本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.取样水体样品过0.45μm滤膜去除杂质，‑4℃条件下，黑暗密封保存；S2.水样预处理采用微波辅助气相酸水解的方法进行：取待测水样，加入抗坏血酸溶液以防止待测溶液中氨基酸发生氧化，加入盐酸溶液，混匀后放入微波消解仪，进行消解得水解液；将所述水解液冷却至室温后，用碱液中和至中性，得待测样品，密封待测；S3.衍生剂制备将N‑异丁酰‑D‑半胱氨酸和邻苯二甲醛溶解到甲醇溶液中，使用缓冲溶液稀释，使得N‑异丁酰‑D‑半胱氨酸的浓度为5‑6g/L和邻苯二甲醛的浓度为2‑2.5g/L，所得溶液为邻苯二甲醛衍生剂，4℃密封保存；S4.衍生反应取待测样品，依次加入邻苯二甲醛衍生剂和缓冲溶液，涡旋器混匀，室温下放置，保证氨基酸与邻苯二甲醛充分发生衍生反应；S5.仪器测定采用高效液相色谱‑荧光检测器进行测定；采用反相C18高效液相色谱柱对D型和L型氨基酸进行分离；其中，色谱柱为：LiChrospher 100RP‑18色谱柱；流动相的组成为：流动相A采用35‑45mmol L

【技术特征摘要】
1.一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.取样水体样品过0.45μm滤膜去除杂质，-4℃条件下，黑暗密封保存；S2.水样预处理采用微波辅助气相酸水解的方法进行：取待测水样，加入抗坏血酸溶液以防止待测溶液中氨基酸发生氧化，加入盐酸溶液，混匀后放入微波消解仪，进行消解得水解液；将所述水解液冷却至室温后，用碱液中和至中性，得待测样品，密封待测；S3.衍生剂制备将N-异丁酰-D-半胱氨酸和邻苯二甲醛溶解到甲醇溶液中，使用缓冲溶液稀释，使得N-异丁酰-D-半胱氨酸的浓度为5-6g/L和邻苯二甲醛的浓度为2-2.5g/L，所得溶液为邻苯二甲醛衍生剂，4℃密封保存；S4.衍生反应取待测样品，依次加入邻苯二甲醛衍生剂和缓冲溶液，涡旋器混匀，室温下放置，保证氨基酸与邻苯二甲醛充分发生衍生反应；S5.仪器测定采用高效液相色谱-荧光检测器进行测定；采用反相C18高效液相色谱柱对D型和L型氨基酸进行分离；其中，色谱柱为：LiChrospher100RP-18色谱柱；流动相的组成为：流动相A采用35-45mmolL-1磷酸二氢钾缓冲溶液，pH＝12；流动相B采用甲醇：乙腈＝13:1(体积比)；采用梯度洗脱。2.根据权利要求1所述的一种淡水水体中D型氨基酸的提取和测定方法，其特征在于，所述水样预处理的具体步骤为：取1ml待测水样，加入100-120μl12mmolL-1抗坏血酸溶液以防止待测溶液中氨基酸发生氧化，加入0.5-0.6ml6molL-1盐酸溶液，混匀后转移至消解罐中，将消解罐放入微波消解反应容器中，向微波消解反应容器加入25ml6molL-1盐酸溶液后密封，抽真空，充入氮气，进行消解。3.根据权利要求2所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙福红，吴丰昌，郭飞，朱元荣，穆云松，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11