The present invention relates to the field of archaeological detection, and discloses a method for preparing monoclonal antibodies against silk fibroin. The method uses isooctane, octanol, bis (2 - ethylhexyl) sulfosuccinate, silk fibroin extracted polyvinyl pyridine quaternary ammonium salt mixture, then the silk fibroin as complete antigen injected into rabbits, selected immune titer of rabbits, the spleen cells and myeloma cell fusion hybridoma cell, obtained after incubation with indirect ELISA method for secretion of antibody positive, antibody secreting ability, cell growth in good condition with limited dilution cloning strains to the positive rate of antibody secreting hybridoma cells was 100%, with the screened cells to production, then the column the use of monoclonal antibody purification. The antibody prepared by the method has strong specificity, and the operation is simple and quick, and the detection accuracy is high.
【技术实现步骤摘要】
一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法
本专利技术涉及考古检测领域，尤其涉及一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
蚕丝是一种天然高分子蛋白质纤维，主要分为柞蚕丝和桑蚕丝两大类。鉴于桑蚕丝的起源问题一直笼罩在迷雾中，迫切需要一种更科学的方法来鉴定出土的丝织品。蚕丝的常规检测方法主要有傅里叶红外光谱、拉曼光谱、X-射线衍射等，但蚕丝长期处于墓葬或遗址环境中会受到多种因素影响，从而出现蛋白质降解及大分子链断裂等问题，采用传统的一些方法很难检测到丝素蛋白的存在。因此如何采用自然科学的先进手段，建立丝织品微痕检测技术体系，从印痕，残留物，土壤中提取古代丝绸的信息，对研究丝绸的起源至关重要。当前蛋白质检测的先进技术是基于抗体-抗原的WesternBlotting或ELISA法，桑蚕丝素蛋白抗体的制备是该研究的一个关键环节。目前已出现了桑蚕丝素蛋白的多克隆抗体，抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，抗原分子具有很多抗原决定簇，因此免疫动物产生的抗体为多种抗体的混合物，要把这些不同的抗体分开十分困难，同时多克隆抗体存在纯度低、理化性状不均一、与抗原结合特异性不强等问题。专...
【技术保护点】
一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：A）称取15g桑蚕丝并将其以1:45‑55的浴比添加至去离子水中，加入2.25‑3.75g碳酸钠，于90‑98℃水浴下恒温脱胶55‑65min，结束后调节pH至中性，反复操作多次，将脱胶后的桑蚕丝加入去离子水中浸泡，然后烘干；B）将450‑550mL异辛烷与900‑1100mL正辛醇混合，搅拌混匀得到混合油性溶剂，称取0.3‑0.5mol的双（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠，0.3‑0.5mol的聚乙烯基吡啶季铵盐溶于450‑550mL前述混合油性溶剂中；C）称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠，加入到700‑80...
【技术特征摘要】
1.一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：A）称取15g桑蚕丝并将其以1:45-55的浴比添加至去离子水中，加入2.25-3.75g碳酸钠，于90-98℃水浴下恒温脱胶55-65min，结束后调节pH至中性，反复操作多次，将脱胶后的桑蚕丝加入去离子水中浸泡，然后烘干；B）将450-550mL异辛烷与900-1100mL正辛醇混合，搅拌混匀得到混合油性溶剂，称取0.3-0.5mol的双（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠，0.3-0.5mol的聚乙烯基吡啶季铵盐溶于450-550mL前述混合油性溶剂中；C）称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠，加入到700-800mL去离子水中，搅拌溶解后定容至1000mL，调节pH至9.5-9.7，得到碳酸盐缓冲溶液；取步骤A）中烘干后的桑蚕丝5g溶于45-55mL碳酸盐缓冲溶液中，搅拌至完全溶解后加入至45-55mL步骤B）所得的混合油性溶剂中，混合均匀，再搅拌处理，然后离心处理，取上层溶液备用；D）称取29.2g氯化钠，加入到450-550mL去离子水中，搅拌溶解后定容至1000mL，调节pH至9.4-9.5，取步骤C）所得上层溶液，按体积比0.9-1.1:1与氯化钠溶液混合，混匀后搅拌处理，然后离心处理，取下层水相；E）取步骤D）所得下层水相，倒入透析袋中进行透析，透析后对透析袋中剩余溶液进行冷冻干燥，对干燥后获得的样品进行研磨，得到桑蚕丝素蛋白完全抗原，备用；F）用生理盐水溶解步骤E）所得桑蚕丝素蛋白完全抗原，控制浓度为1-2mg/mL，然后与QuickAntibody-Rabbit8W按体积比0.9-1.1:1混合，制得抗原佐剂混合溶液；选取2只大白兔进行初次免疫，用抗原佐剂混合溶液对每只兔的后大腿和皮下进行多点注射，在完成初次免疫后的第3周使用同样的抗原佐剂混合溶液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；第5周选取免疫后效价相对较高的大白兔进入单克隆抗体制备；G）用0.4-0.6mg步骤E）所得桑蚕丝素蛋白完全抗原对选取的大兔进行静脉注射，7天后在无菌条件下取出脾脏，在无菌培养皿中将脾脏清理干净，用1640培养液冲洗，将洗净后的脾脏放入无菌皿中，加入1640培养液10mL，将脾脏碾碎过筛网，然后用1640培养液悬浮，在10000-14000rpm下离心4-6min，移除上清液，再洗涤一次，得到细胞悬液，并将其浓度稀释为含有1×108个脾淋巴细胞的悬液，备用，在细胞融合试验前5天，另行取骨髓瘤细胞进行传代培养；H）取步骤G）培养得到的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞按1.8-2.2:1的数量比混匀，加培养液后在10000-14000rpm下离心4-6min，弃上清液，在35-39℃水浴中恒温加热，并缓缓加入聚乙二醇-1500，再加入1640培养液稀释，在10000-14000rpm下离心，弃上清后将细胞用20%HAT选择培养液悬浮；I）步骤H）中细胞融合10天后，用间接ELISA法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，用HAT培养基扩大培养后，用有限稀释法在96孔板内进行克隆化，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%；利用筛选出的细胞进行大转生产，收集兔单克隆抗体进入纯化阶段；J）pH7.4的PBS溶液的制备；K）对步...
【专利技术属性】
技术研发人员：王秉，李津，梁军龙，陈茹茹，陈博逸，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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