一种肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目绝对定量的测量方法技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目绝对定量的测量方法。本方法通过EGFP标记促凋亡蛋白质，并通过流式细胞术测量肿瘤细胞所能耐受促凋亡蛋白质分子时的EGFP数值，通过FITC标记的荧光微球以及FITC与EGFP的激发荧光强度的换算，实现肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目的绝对定量的测量。本发明专利技术方法不仅解决了传统研究中蛋白质含量增加多少倍引起细胞凋亡而缺少绝对数值的问题，也避免了利用BH3分析方法中遇到的BH3小肽的活性问题以及BH3小肽与BH3蛋白质之间的区别问题，实现了肿瘤活细胞耐受促凋亡蛋白质分子的绝对定量测试。

A method for absolute quantification of molecular numbers of tumor cells tolerant to apoptosis promoting proteins

The present invention provides a method for measuring absolute quantification of tumor cell tolerance to apoptotic protein molecules. The method of Pro apoptotic proteins by EGFP markers, and measured by flow cytometry of tumor cells to EGFP induced apoptosis tolerance numerical protein molecular, by FITC labeled fluorescent microspheres and fluorescence intensity of FITC and EGFP conversion, realize the quantitative measurement of absolute tolerance of tumor cells to apoptosis of the number of protein molecules. The method of the invention not only solves the traditional research of protein content increased many times caused apoptosis and the lack of absolute values, but also to avoid the activity analysis of BH3 peptide method encountered in the use of BH3 and the difference between BH3 and BH3 protein peptide, realizes absolute quantitative test live tumor cell apoptosis protein tolerance molecule.

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目绝对定量的测量方法
本专利技术属于分析检测领域，具体涉及肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目绝对定量的测量方法。
技术介绍
肿瘤严重危害人类健康。近年来大量研究表明肿瘤的发生，发展和治疗都与细胞凋亡有着紧密的联系。细胞凋亡信号通路主要包括死亡受体通路和线粒体通路。死亡受体通路中当死亡受体（例如DR4,DR5等）与其配基结合（例如TRAIL）后，就可以促进细胞凋亡，所以这些死亡受体都是促凋亡蛋白质。线粒体细胞凋亡途径主要是由BCL2家族控制的。BCL2蛋白质家族成员分为抗凋亡蛋白质和促凋亡蛋白质，促凋亡蛋白质又包括仅含BH3结构域的促凋亡蛋白（BIM、PUMA、NOXA、BMF、BAD、HRK等）和多结构域促凋亡蛋白BAX和BAK。BCL2家族通过蛋白质相互作用调控线粒体膜的通透性，控制线粒体内细胞色素c等一系列促凋亡蛋白质的释放，激活caspase，从而引起一系列细胞凋亡反应。其它的细胞内很多蛋白质也是促凋亡蛋白质（例如P53，ERK），它们通过促进下游的促凋亡蛋白质的转录表达或者提高下游促凋亡蛋白质在细胞内的稳定性等方式来促进细胞凋亡。细胞凋亡对于肿瘤研究至关重要。一方面，抗凋亡BCL2家族蛋白质在多种肿瘤中高表达。另一方面，很多抗肿瘤药物，包括DNA损伤类药物、激酶抑制剂和微管聚集抑制剂等，也是通过诱导线粒体细胞凋亡途径来杀死肿瘤细胞的。不仅如此，很多促凋亡蛋白质的类似物已经成为抗肿瘤药物或正在进行临床试验。例如，促凋亡蛋白质BAD的BH3的类似物navitoclax，能特异性抑制BCL2,BCLxL和BCLw，从而引起肿瘤细胞凋亡，目前正在多种肿瘤进行临床试验。而更特异性的BCL2抑制剂venetoclax已经被批准用于复发性慢性淋巴细胞性白血病的治疗。所以，测量肿瘤细胞凋亡耐受促凋亡蛋白质的绝对分子数目不仅有助于我们预测抗肿瘤药物对某种特定肿瘤的治疗疗效，也有助于我们判断哪些蛋白质分子是有效的药物靶分子。比较早期的研究方法通常是通过免疫印迹的方法来发现哪些促凋亡蛋白质在细胞内表达增加，然后通过过表达的方法来验证这些蛋白质确实具有促凋亡作用，并不能实现定量分析（PuthalakathH,等.Celldeathanddifferential,2002,9(5):505-512；LiR,等.Celldeathanddifferential,2005,12(3):292-303）。近年来陆续发展的BH3分析的方法（DengJ,等.CancerCell,2007,12:171-185；VoTT,等.Cell,2012,151:344-355），然而，该方法有着其局限性：(1)BH3蛋白质相应的BH3小肽并不能完全反应BH3蛋白质，研究显示BH3小肽的活性与仅含BH3蛋白质之间的活性是有区别的（DaiH,等.TheJournalofBiologicalChemistry,2014,289:89-99）；(2)因为该方法是使用分离的线粒体完成的，所以利用BH3小肽检测的方法只适用于线粒体细胞凋亡途径，而不能在其它的促凋亡蛋白质上加以运用。
技术实现思路
本专利技术提供一种肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目绝对定量的测量方法。通过EGFP标记促凋亡蛋白质，并通过流式细胞术测量肿瘤细胞所能耐受促凋亡蛋白质分子时的EGFP数值，通过FITC标记的荧光微球以及FITC与EGFP的激发荧光强度的换算，实现肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目的绝对定量的测量。本专利技术采用的技术方案如下：（1）首先利用EGFP末端标记促凋亡分子DNA，通过转导的方法转入活细胞中；（2）在细胞生长一定时间后（24小时或者48小时），使这些促凋亡分子过量表达；（3）然后加入荧光染料APC标记的AnnexinV来标记凋亡细胞，通过流式细胞仪检测分析肿瘤细胞耐受EGFP偶联的促凋亡分子的EGFP荧光强度；（4）在流式细胞仪检测分析的同时，做一管带有标准FITC荧光微球的参照管，这种荧光微球是可以得到关于每个荧光微球上FITC数量与荧光强度的相关直线；（5）再通过荧光光谱仪测定一定量的FITC和EGFP之间的在流式细胞仪测量波长范围内发射光强度的换算关系，可以得到肿瘤细胞耐受促凋亡分子的EGFP的绝对数值；因为一个EGFP与一个促凋亡分子相连，该数值即为肿瘤细胞耐受促凋亡分的绝对数值。本专利技术的检测方法的具体工作过程如下：（1）通过分子克隆的方法将所需测量的目标促凋亡分子的cDNA与EGFP分子的cDNA连接克隆在高表达载体内，根据需求可以将其放在EGFP的N端或者C端；（2）通过电转、病毒转染等方法将质粒转染到被测试的肿瘤细胞中；（3）24小时或者48小时后，收集细胞，用APC-标记的AnnexinV染色，并通过流式细胞仪采集肿瘤细胞中EGFP/APC的荧光强度信息，从而引起肿瘤细胞耐受促凋亡分子临界点的EGFP的荧光强度信息；（4）在采集样品的同时，需利用流式细胞仪在同样的工作条件下同时采集含有一定数量的梯度FITC的标准荧光微球的荧光强度信息，做出FITC荧光强度与数量的直线关系图；（5）体外纯化标准的EGFP蛋白质，购买FITC，通过荧光分光光度计检测与流式细胞仪检测波长范围一致的相同分子数的EGFP蛋白质与FITC激发光强度的换算关系；（6）将肿瘤细胞耐受促凋亡分子临界点的EGFP的荧光强度信息换算成EGFP的分子数目，从而得到所需的促凋亡分子的绝对数值。本专利技术与现有技术相比的区别和优点在于：（1）本方法测量的为细胞内的促凋亡蛋白质分子的数目，不同于细胞外的实验，更能反应活细胞的耐受的促凋亡分子数目；（2）本方法测量的是一个绝对数目，不是蛋白质含量相对的增长多少倍可以引起细胞凋亡，因此可以根据该绝对数目对肿瘤细胞所需要的促凋亡分子类似药物浓度进行估算；（3）本方法测量的是具有活性的蛋白质引起细胞凋亡的分子数目，可以解决小肽方法中小肽的活性问题以及小肽与蛋白质活性区别的问题；（4）本方法不仅可以对BH3类似物促凋亡分子的绝对量进行测算，还可以对肿瘤细胞耐受其它蛋白质分子（例如DR4，ERK，P53等）的绝对量进行测算。（2）本专利技术的创新之处在于：通过将促凋亡蛋白质与EGFP分子相连接，EGFP标记的粗凋亡蛋白质与APC-AnnexinV相结合监测细胞凋亡，定量FITC标记的荧光微球的应用，以及FITC与EGFP之间的巧妙换算，成功地实现了测量肿瘤活细胞耐受促凋亡蛋白质分子的绝对定量。该方法不仅解决了传统研究中蛋白质含量增加多少倍引起细胞凋亡而缺少绝对数值的问题，也避免了利用BH3分析方法中遇到的BH3小肽的活性问题以及BH3小肽与BH3蛋白质之间的区别问题，实现了肿瘤活细胞耐受促凋亡蛋白质分子的绝对定量测试。附图说明图1为本专利技术方法实施的流程图；图2为通过流式细胞仪分析Jurkat细胞耐受促凋亡分子BIMEL、PUMA、NOXA、BMF阈值示意图；图3为通过FITC标准荧光微球换算荧光强度与FITC分子数目的示意图；图4为换算纯化的EGFP与FITC发射光荧光强度的示意图；图5为通过该方法获得的Jurkat细胞及SKW6.4细胞耐受促凋亡分子的阈值绝对数目的测量结果图。具体实施方式本专利技术方法实施流程如图1所示。具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目绝对定量的测量方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用EGFP末端标记促凋亡分子DNA来实现对促凋亡分子的标记，为活细胞内定量测量做准备；（2）通过荧光染料APC标记的Annexin V来标记凋亡细胞，实现凋亡细胞的检测；（3）通过流式细胞仪检测分析肿瘤细胞耐受促凋亡分子相应的EGFP的荧光强度；（4）使用带有不同数量的标准FITC荧光微球的参照管来实现绝对定量；（5）通过荧光光谱仪测定一定量的FITC和EGFP分子发射光强度来实现FITC与EGFP的换算，得到可以得到肿瘤细胞耐受促凋亡分子的EGFP的绝对数值。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目绝对定量的测量方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用EGFP末端标记促凋亡分子DNA来实现对促凋亡分子的标记，为活细胞内定量测量做准备；（2）通过荧光染料APC标记的AnnexinV来标记凋亡细胞，实现凋亡细胞的检测；（3）通过流式细胞仪检测分析肿瘤细胞耐受促凋亡分子相应的EGFP的荧光强度；（4）使用带有不同数量的标准FITC荧光微球的参照管来实现绝对定量；（5）通过荧光光谱仪测定一定量的FITC和EGFP分子发射光强度来实现FITC与EGFP的换算，得到可以得到肿瘤细胞耐受促凋亡分子的EGFP的绝对数值。2.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目绝对定量的测量方法，其特征在于，（1）首先利用EGFP末端标记促凋亡分子DNA，通过转导的方法转入活细胞中；（2）在细胞生长一定时间后使这些促凋亡分子过量表达；（3）然后加入荧光染料APC标记的AnnexinV来标记凋亡细胞，通过流式细胞仪检测分析肿瘤细胞耐受EGFP偶联的促凋亡分子的EGFP荧光强度；（4）在流式细胞仪检测分析的同时，做一管带有标准FITC荧光微球的参照管，这种荧光微球是可以得到关于每个荧光微球上FITC数量与荧光强度的相关直线；（5）再通过荧光光谱仪测定一...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴海明，王宏志，江海河，王姝洁，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽,34