一种荧光探针及其合成方法和在循环肿瘤细胞检测中的应用技术

本发明专利技术公开了一种荧光探针及其合成方法和在循环肿瘤细胞检测中的应用。本发明专利技术荧光探针包括荧光基团、组织蛋白酶B的底物和叶酸分子，荧光基团与组织蛋白酶B的底物通过自降解键连接，再与叶酸分子连接；荧光基团在游离状态能被激发光激发，与其它分子共价连接后淬灭。因本发明专利技术荧光探针为具有自发级联扩增功能的开关型荧光探针，用于循环肿瘤细胞检测过程中可避免抗体或核酸检测等复杂的操作步骤，作为配套试剂用于自动化生化分析仪中，有利于促进肿瘤细胞的自动化检测，具有操作简单便捷、耗时短、对仪器要求低等优点。本发明专利技术荧光探针还可以用于临床手术中微小肿瘤细胞、结节的定位，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

A fluorescent probe and its synthetic method and its application in detection of circulating tumor cells

The invention discloses a fluorescent probe and its synthetic method and its application in detecting circulating tumor cells. The invention comprises a substrate and a fluorescent probe of folic acid molecule fluorescence group, cathepsin B, cathepsin B and fluorescent substrate by connecting the self degradation of keys, and then connect with the folate molecule; fluorescent groups can be excited in a free state, and other molecules covalently connected after quenching. Because of the invention has a switch type fluorescent probes for fluorescent probe amplification of spontaneous cascade function, for the detection of circulating tumor cells can be avoided during the operation steps of antibody or nucleic acid detection complex, as reagents for automated biochemical analyzer, is conducive to the promotion of automatic detection of tumor cells, with simple and convenient operation, short time, low requirement the advantages of the instrument. The fluorescent probe can also be used for the location of tiny tumor cells and nodules in clinical operation, and has broad application prospect and great market value.

【技术实现步骤摘要】
一种荧光探针及其合成方法和在循环肿瘤细胞检测中的应用
本专利技术属于生物化学检测
，更具体地说，涉及一种以组织蛋白酶B为靶点的荧光探针及其合成方法和在肿瘤检测中的应用。
技术介绍
肿瘤是全球首位的致死性疾病，其发病率和死亡率一直居于各疾病前列，且近年来有快速增长的趋势。由于肿瘤发病比较隐匿，在患者有临床症状时一般都已发生转移，据统计超过90％的肿瘤患者死于肿瘤转移。外周血肿瘤细胞数量极少，且存在大量正常细胞的干扰，检测较困难。目前常用的检测技术主要有常规的细胞学染色检测、免疫细胞化学技术。这类方法大多通过对外周血、腹腔或肿瘤区域的肿瘤细胞进行收集、离心，并采用等常规的苏木精-伊红染色法进行游离肿瘤细胞的检测，过程繁杂，阳性率很低。近些年发展起来的新型的诊断技术有流式细胞检测技术、聚合酶链反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应、免疫磁珠及基于肿瘤体积及形变能力而设计的滤膜过滤法及微流控检测技术。基于PCR的检测方法优势是灵敏度极高，能检测到数个甚至单个的肿瘤细胞。然而肿瘤细胞很难找到非常特异性的mRNA标志物，一些正常细胞也会有极低的肿瘤标志物基因的表达，高灵敏度的PCR时常将这些本底表达扩大，导致假阳性的结果。而常规染色剂免疫组化操作过程繁琐，灵敏度较低，且肿瘤细胞在操作过程中容易丢失，引起假阴性等问题。最近几年随着材料和工程学的发展，基于微流控的细胞检测技术有很大的发展，已出现较多新颖且便捷的检测技术及装置。微流控技术在肿瘤检测方面有灵敏、便捷和样本量少的优势，但这些方法还是基于常规PCR或者免疫荧光法，对肿瘤标志基因或肿瘤抗原有很大的依赖，且检测过程需要多个洗脱步骤，导致肿瘤细胞的丢失，因此准确性及可靠度仍需进一步验证。上述几种检测方法均依赖实验室人工操作，人为因素影响较大，因此自动化或半自动化的诊断仪器更适合医院等单位使用。目前国际上最通用的自动化检测设备是美国强生公司推出的基于免疫磁珠分离的循环肿瘤细胞检测与分析系统(CellSearchSystem)。该设备也是国际首台获得美国食品药品管理局(FDA)认证且被大量临床研究证实其有效性及可靠性的设备。检测时利用癌细胞通用标志物及血细胞通用标志物对血液中的肿瘤细胞进行正向和负向的分选，再对得到的细胞上特异性的肿瘤蛋白标记物进行标记和染色，最后通过半自动显微镜扫描计数。该方法的优势是检测能实现半自动化，灵敏度高，但其检测费用昂贵，单次收费5000-8000元人民币，给患者带来较大的经济负担。总体而言，目前国内外临床上使用的CTC诊断方法均须以下几步：1.对外周血进行分离和富集；2.提取核酸进行扩增或对肿瘤抗原进行标记；3.电泳、测序检测DNA或显微镜观察计数。这这些方法均涉及多个洗脱和回收步骤，肿瘤细胞的丢失现象普遍存在，人工操作过程的增加也导致检测误差因素的增多，而且很多肿瘤细胞并不表达或者低表达一些常规标志分子，因此也在很大程度上影响CTC的检出率。最重要的一点是这些技术均难以与现有检测设备结合实现CTC诊断的全自动化，不利于检测稳定性和准确性的提高。有鉴于此，确有必要提供一种灵敏度高、操作简便快捷、成本较低的肿瘤细胞检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：克服现有肿瘤细胞检测中存在的成本高、操作复杂、准确性较差等问题，提供一种灵敏度高、操作简便快捷、成本较低的荧光探针及其合成方法和应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供一种荧光探针，其包括荧光基团、组织蛋白酶B的底物和叶酸分子，荧光基团与组织蛋白酶B的底物通过自降解键连接，再与叶酸分子连接；荧光基团在游离状态能被激发光激发，与其它分子共价连接后淬灭。因量子产率很低，所以该荧光探针在底物保护状态下很难被激发光激发，在底物保护下不能发出荧光或只发射极弱荧光。作为本专利技术荧光探针的一种改进，所述组织蛋白酶B的底物为苯丙氨酸-赖氨酸。作为本专利技术荧光探针的一种改进，所述自降解键由至少两个骨架单元首尾连接形成(一个骨架单元的氨基与下一个骨架单元的羟基连接)，骨架单元由氨基苯甲醇、氨基苯二甲醇和氨基苯三甲醇连接组成。作为本专利技术荧光探针的一种改进，一个组织蛋白酶B的底物可结合若干个荧光基团，当组织蛋白酶B的底物结合一个荧光基团时，为单倍荧光探针；当结合两个荧光基团时，为2倍放大荧光探针，以此类推。荧光探针的倍数越高，其检测灵敏度也越高。为了实现上述专利技术目的，本专利技术还提供上述荧光探针的合成方法，包括如下步骤：(1)以苄氧羰基保护的苯丙氨酸酯与二碳酸二叔丁酯(PG1)保护的赖氨酸反应，得到赖氨酰苯丙氨酸酯；(2)将赖氨酰苯丙氨酸酯与氯甲酸异丁酯反应，得到酸酐中间体；(3)酸酐中间体与荧光基团-赖氨酰苯丙氨酸酯反应，得到连接有荧光基团的中间体；(4)使用三氟乙酸脱去连接有荧光基团的中间体上的Boc保护基，然后与叶酸在酰胺化试剂体系下发生缩合反应，使叶酸与连接有荧光基团的中间体偶联，再经肼解脱去赖氨酸上的保护基PG1，得到荧光探针。为了实现上述专利技术目的，本专利技术还提供了一种循环肿瘤细胞检测方法，该检测方法是基于所述荧光探针完成。作为本专利技术循环肿瘤细胞检测方法的一种改进，所述检测方法中，所述荧光探针与肿瘤样本直接混合孵育检测，或将所述荧光探针制备成脂质体或包裹于纳米材料中，再与肿瘤样本混合孵育检测。作为本专利技术循环肿瘤细胞检测方法的一种改进，所述肿瘤样本包括血液样本、组织样本或手术中体内待测组织。作为本专利技术循环肿瘤细胞检测方法的一种改进，当所述肿瘤样本为血液样本或组织样本时，用缓冲液溶解所述荧光探针，将所述荧光探针与血液样本或组织样本在37℃下孵育5min～1h，然后检测荧光强度；当所述肿瘤样本为手术中体内待测组织时，将所述荧光探针直接涂布在体内待测组织上，在特定LED灯照射的引导下进行手术切除肿瘤组织。为了实现上述专利技术目的，本专利技术还提供了一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其包括所述荧光探针和反应缓冲液。作为本专利技术循环肿瘤细胞检测试剂盒的一种改进，其中，所述荧光探针可预先制备成脂质体或包裹于纳米材料中。作为本专利技术毒素蛋白的纯化方法的一种改进，步骤(4)中，所述混合静置反应的温度为25℃。作为本专利技术毒素蛋白的纯化方法的一种改进，步骤(4)中，所述纯化是蛋白亲和层析纯化。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1)本专利技术荧光探针在底物保护下不发荧光或只发射极弱荧光，但在组织蛋白酶B作用下可切割掉底物，导致荧光基团释放出来，产生能被激发出高荧光的游离荧光分子；使用本专利技术荧光探针检测肿瘤细胞时，无需对肿瘤细胞进行分离等操作，具有简单快捷、耗时短、对仪器要求低、利于自动化检测的优点；2)本专利技术荧光探针为具有自发级联扩增功能的开关型荧光探针，用于肿瘤细胞检测，可避免抗体以及核酸检测中复杂的操作，还可作为配套试剂用在自动化生化分析仪中，有利于肿瘤细胞/CTC的自动化检测，不仅提高了灵敏度，还增加了检测通量和便捷性，弥补了现有检测方法的不足；3)本专利技术荧光探针在未酶切状态下为淬灭状态，因此也可用于临床手术中微小肿瘤细胞或结节的定位，作为手术的辅助手段；4)与传统的甲基蓝、鲁戈氏碘液等需要进行冲洗的肿瘤染色液相比，本专利技术荧光探针在操作简易性、特异性或灵敏度方面均有巨大的优势，具有良好的应用前景和经济价值。附图说明下面结合附图和具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光探针，其特征在于，包括荧光基团、组织蛋白酶B的底物和叶酸分子，荧光基团与组织蛋白酶B的底物通过自降解键连接，再与叶酸分子连接；荧光基团在游离状态能被激发光激发，与其它分子共价连接后淬灭。

【技术特征摘要】
1.一种荧光探针，其特征在于，包括荧光基团、组织蛋白酶B的底物和叶酸分子，荧光基团与组织蛋白酶B的底物通过自降解键连接，再与叶酸分子连接；荧光基团在游离状态能被激发光激发，与其它分子共价连接后淬灭。2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述组织蛋白酶B的底物为苯丙氨酸-赖氨酸；所述自降解键由至少两个骨架单元首尾连接形成，骨架单元由氨基苯甲醇、氨基苯二甲醇和氨基苯三甲醇连接组成。3.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光基团为若干个。4.权利要求1～3中任意一条权利要求所述荧光探针的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以苄氧羰基保护的苯丙氨酸酯与二碳酸二叔丁酯保护的赖氨酸反应，得到赖氨酰苯丙氨酸酯；(2)将赖氨酰苯丙氨酸酯与氯甲酸异丁酯反应，得到酸酐中间体；(3)酸酐中间体与荧光基团-赖氨酰苯丙氨酸酯反应，得到连接有荧光基团的中间体；(4)使用三氟乙酸脱去连接有荧光基团的中间体上的Boc保护基，然后与叶酸在酰胺化试剂体系下发生缩合反应，使叶酸与连接有荧光基团的中间体偶联，再经肼解脱去赖氨酸上的保护基PG1，得到荧光探针。5.一种循环肿瘤细胞检测方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：方志远，蒋白山，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第五医院，
类型：发明
国别省市：广东,44