抗菌五肽衍生物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗菌五肽衍生物，该抗菌五肽衍生物的序列为：Arg‑Arg‑Trp‑Trp‑Arg‑β‑苯乙胺。应用于制备治疗或预防细菌感染的药物中。所述细菌为耐药鲍曼不动杆菌。本发明专利技术提供的新的人工设计合成的抗菌五肽衍生物，可方便地采用固相合成法获得。该合成抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有广谱杀伤活性，尤其对耐药鲍曼不动杆菌表现出更强的抗菌活性，且溶血毒性极小，能够应用于治疗或预防因耐药鲍曼不动杆菌而引起的疾病的药物中。

Antibacterial five peptide derivative and its application

The invention discloses an antibacterial peptide derivative five, the sequence of five antimicrobial peptide derivatives: Arg Arg Trp Trp Arg beta phenylethylamine. Used in the preparation of drugs for the treatment or prevention of bacterial infections. The bacteria were resistant to Bauman acinetobacter. The new artificially synthesized antibacterial five peptide derivative provided by the invention can be conveniently obtained by solid phase synthesis. The synthesis of antimicrobial peptides with broad-spectrum cytotoxic activity against gram positive and gram negative bacteria, especially for drug resistant Acinetobacter Bauman exhibited stronger antibacterial activity and hemolytic minimal toxicity, can be used in the treatment or prevention of drug resistant Acinetobacter Bauman because of diseases caused by drugs.

【技术实现步骤摘要】
抗菌五肽衍生物及其应用
本专利技术涉及一种抗菌五肽衍生物及其应用，属于生物

技术介绍
全球每年的细菌感染病患高达15亿人，其中死亡人数460万，特别是多药耐药菌(MDRB)感染导致的高死亡率，严重威胁公众健康。欧洲与美国每年因细菌感染防治的支出高达70亿欧元和65亿美元，而发展中国家则需为此承担更为高昂的代价。MDRB感染在全球的快速蔓延与抗生素滥用及其研发断代密切相关，即1962至2000年间并未开发出新结构类型的抗生素；2000年以来仅有3个新结构类型的抗菌药物进入市场。美国感染病学会(IDSA)自2004年开始呼吁振兴抗生素研发并给予项目资助，拟在2020年前开发10个结构全新的抗菌药物。可以预测，抗MDRB感染药物的研发将获得快速发展。鲍曼不动杆菌(AB)是一种严重的医源性病原菌，导致呼吸道、血液、尿道、软组织及中枢神经系统感染，在病患之间通过直接或间接接触方式传播。根据2006-2007年国内外院内感染监测数据资料显示，鲍曼不动杆菌在院内感染中的检出率居前四位，在免疫力低下的患者中，可以引起严重的甚至致死性的感染。它可以引起呼吸机相关性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染和中枢神经系统感染等严重感染性疾病。由于鲍曼不动杆菌感染引起的发病率和病死率增加，其被称为“革兰阴性的MRSA”。在常规AB感染中，多药耐药鲍曼不动杆菌(MRAB)的发生率从2004年的23％上升到2014年的63％，其平均发生率也显著高于其他革兰氏阴性菌(44％vs13％)。目前，95％的MRAB对头孢曲松有抗性，90％的MRAB对头孢他啶、左氧氟沙星、美罗培南、哌拉西林-他唑巴坦等药物耐药，是临床耐药菌感染疾病治疗的一大难题。因此，筛选结构新颖的抗菌药物以应对MRAB感染将成为新药研发的热点。抗菌肽(AMP)是存在于所有生物体中的一类短肽，具有阳离子性和两亲性的特点且结构多样，是生物体天然免疫系统对抗病原菌入侵的重要组成部分，在生物进化过程中保持稳定和高效。截至目前，文献已报道约5000条AMP序列，其中74条已进入药物开发阶段。由于AMP主要以细菌细胞膜为作用靶标，与传统抗生素的作用机制存在显著区别，对MDRB具有显著的抗菌效果，是对抗MDRB最具发展潜力的候选结构类型。然而，天然AMP仍然存在氨基酸序列长、生产成本高，耐酶稳定性差、体内易降解，以及细胞溶解毒性等问题，其在临床应用上面临严重困境。通过化学合成方法获得的非天然小分子抗菌肽(sAMP)，其序列仅由3-9氨基酸残基构成，由于非天然氨基酸(如D-型氨基酸或氨基酸残基修饰物)的存在，使其具有活性显著、结构简单、易于合成、稳定性好、安全性高等优势，受到研究人员的广泛关注。因此，通过化学合成方法发现抗菌活性强、耐酶稳定性好、体内安全性高的sAMP及其类似物，是解决MRAB感染问题的有效途径。
技术实现思路
针对现有的问题，本专利技术的第一目的在于提供一种抗菌五肽。本专利技术的另一目的在于提供该种抗菌五肽的应用，该抗菌五肽对革兰氏细菌有光谱抗菌活性，能高效抑制耐药鲍曼不动杆菌的生长，并且该抗菌五肽的毒性小。为了实现上述第一目的，本专利技术的技术方案为：一种抗菌五肽衍生物，其特征在于：该抗菌五肽衍生物的序列为：Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-β-苯乙胺(抗菌肽b)。本专利技术思路如下：在天然抗菌肽LactoferricinB4-9RRWQWR基础上，结合虚拟组合库设计技术，DNAstar，Bioedit，sequencelogo等分析软件和网站，经过多次试验后发现一条具有抗菌活性的全新多肽序列RRWWR-NH2(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-NH2)，在其C端苯乙胺化后仍具有显著的抗菌活性。新发现的抗菌五肽苯乙胺修饰物相比LfcinB4-9杀菌效果更佳，尤其对耐药鲍曼不动杆菌表现出更强的杀菌活性，无溶血毒性，有望作为治疗细菌感染尤其是耐药鲍曼不动杆菌的新药研究和开发。利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪基于固相合法制备成本专利技术公开的抗菌五肽苯乙胺修饰物和作为对照的Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-NH2(抗菌肽a)以及天然抗菌肽LactoferricinB4-9RRWQWR。为了实现上述第二目的，本专利技术的技术方案为：如上所述抗菌五肽衍生物的应用，应用于制备治疗或预防细菌感染的药物中。进一步的：所述细菌为耐药鲍曼不动杆菌。此处的耐药鲍曼不动杆菌为广义上的耐药鲍曼不动杆菌，包括耐单种药的鲍曼不动杆菌和耐多重药的鲍曼不动杆菌。利用琼脂空板穴扩散法和96孔板法检测本专利技术抗菌五肽衍生物的抑菌和杀菌活性，以预先合成的天然抗菌肽LactoferricinB4-9RRWQWR以及抗菌肽a为对照1和2，进行杀菌活性检测，结果表明本专利技术的抗菌肽的杀菌活性显著强于对照1天然抗菌肽LactoferricinB4-9RRWQWR的杀菌活性。与对照2相比，本专利技术的抗菌肽b在低浓度的条件下就能高效抑制耐药鲍曼不动杆菌的生长。能够应用于治疗或预防因耐药鲍曼不动杆菌而引起的疾病的药物中，如应用于治疗因耐药鲍曼不动杆菌而引起的呼吸机相关性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染和中枢神经系统感染等严重感染性疾病的药物中。抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，就可以通过检测其OD490值确定毒性的大小。实验表明，在高浓度下本专利技术的抗菌五肽衍生物溶血率依然非常低，证实本专利技术抗菌五肽衍生物的溶血毒性极小。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供一种新的人工设计合成的抗菌五肽苯乙胺修饰物，可方便地采用固相合成法获得。该合成抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有广谱杀伤活性，尤其对耐药鲍曼不动杆菌表现出更强的抗菌活性，且溶血毒性极小，能够应用于治疗或预防因耐药鲍曼不动杆菌而引起的疾病的药物中。附图说明图1为本专利技术抗菌五肽衍生物的质谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的描述：实施例1：化学合成抗菌肽a和抗菌肽b及对照抗菌肽LactoferricinB4-9。抗菌肽a:RRWWR-NH2(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-NH2)抗菌肽b：RRWWR-PEA(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-β-苯乙胺)1、抗菌肽a(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-NH2)的制备：制备从C端到N端逐个进行，由合成仪自动控制。首先，称量0.01mol结合了第一个氨基酸即Arg的树脂(购于美国应用生物系统公司)，装柱；再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解于碳二亚胺(DCC)，羟基苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30min，三氟乙酸(TFA)清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤直到制备结束(具体操作步骤见pioneer多肽合成仪操作指南)，以乙醚将三氟乙酸中的多肽析出，清洗，形成固体粗品多肽。抗菌肽a的纯化称量100mg干燥后的上述固体粗品多肽，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌五肽衍生物，其特征在于：该抗菌五肽衍生物的序列为：Arg‑Arg‑Trp‑Trp‑Arg‑β‑苯乙胺。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌五肽衍生物，其特征在于：该抗菌五肽衍生物的序列为：Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-β-苯乙胺。2.权利要求1所述抗菌五肽衍生物的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：王远强，张玉萍，唐光辉，周朋朋，高阳阳，胡勇，林治华，
申请(专利权)人：重庆理工大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50