一株解酯耶氏酵母菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术微生物领域，具体涉及一株生物转化生产γ‑癸内酯的解酯耶氏酵母Yarrowialipolytica(命名为NYL01)菌株及其应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M2015696，保藏日期为2015年11月24日。该菌株具有高产天然γ‑癸内酯、底物转化率高、培养条件简单等优良特性。

A strain of yeast and its application

The invention belongs to the field of microbial biotechnology, ester \s yeast Yarrowialipolytica solution to a specific strains of bioconversion the gamma Decalactone (named NYL01) strain and its application. The strain is preserved in the typical culture preservation center of China (CCTCC), and its preservation address is Wuhan University, Wuhan, China. The preservation number is CCTCCNO:M2015696, and the preservation date is November 24, 2015. The strain with high yield of natural gamma decanolactone substrate, high conversion rate, excellent characteristics such as simple culture conditions.

【技术实现步骤摘要】
一株解酯耶氏酵母菌株及其应用
本专利技术属于生物技术微生物领域，具体涉及一株生物转化生产天然手性γ-癸内酯的解酯耶氏酵母Yarrowialipolytica(命名为NYL01)菌株及其应用。
技术介绍
γ-癸内酯是含有五元内酯环的十碳化合物，具有浓郁的桃子和椰子香气，存在于多种水果及乳制品中，是国际公认安全的食品添加剂和药品添加剂。因其具有诱人香味和低香气阈值的特性，在香料工业得到了广泛的应用。目前，γ-癸内酯主要从水果中提取或是化学合成。由于水果中含量极低，天然提取获得的途径存在成本高昂、受季节限制等弊端。有关食品添加剂和药品添加剂的规定又严格限制化学合成产品的使用，同时，随着消费者对天然产品需求的上升，利用生物技术生产天然香料越来越受到人们的重视。微生物法是生产较安全的、高生物活性的香味化合物及其复合物最有前途的方法。由于微生物法生产的γ-癸内酯具有旋光活性，在香料行业有特殊用途，使其更具有研究和实用价值。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术的第一个目的是提供解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01菌株，其具有高产γ-癸内酯、底物转化率高、培养条件简单等优良特性。本专利技术的第二个目的是提供上述的解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01菌株在制备天然γ-癸内酯的应用。为了解决上述的第一个目的，本专利技术采用了以下方案：一株解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M2015696，保藏日期为2015年11月24日。本专利技术从浙江省各地收集的土壤样本中分离纯化获得628株微生物菌株，经筛选获得1株高产γ-癸内酯菌株。根据形态特征和ITS区序列比对，鉴定为解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。本专利技术将获得的解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)菌株进行原生质体诱变，筛选获得了一株高产γ-癸内酯的正突变菌株，编号为NYL01(以下简称“解酯耶氏酵母NYL01菌株”)该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M2015696，保藏日期为2015年11月24日。解酯耶氏酵母NYL01菌株的形态特征：在YPD固体培养基上28℃培养2d，形成较典型的酵母菌落；边缘光滑而饱满，呈乳白色，直径约2～3mm(附图1)；显微镜观察细胞呈卵圆形，个体较细菌大得多，长直径约5～10微米，无鞭毛，有明显的细胞核，能看到部分细胞处在出芽繁殖的过程中(附图2)。解酯耶氏酵母NYL01菌株ITS区基因测序比对结果显示，310bp的保守序列与解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)吻合(附图3和附图4)。为了解决上述第二个目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种生物转化法制备γ-癸内酯的方法，该方法包括以下步骤：a.用接种环挑取适量解酯耶氏酵母NYL01菌株菌落，转接于YPD液体培养基，扩增培养20h，制得种子液。b.按10％接种量取种子液加入转化培养基，200r/min，28℃摇床培养60h。作为优选，所述的YPD液体培养基由以下组分构成：葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母粉1％、水1L，pH5.0～5.5。作为优选，所述的转化培养基由以下组分构成：葡萄糖2％、酵母粉1％、蓖麻油酸10％、磷酸二氢钾0.05、磷酸氢二钠0.03％、硫酸镁0.01％、吐温0.4％，水1L。pH自然。解酯耶氏酵母NYL01菌株具有高产γ-癸内酯、底物转化率高、培养条件简单等优良特性。在上述培养方法下，28℃培养60h，γ-癸内酯的产量达到4.5g/L以上，远远超过该领域的γ-癸内酯生物合成效率，利于工业扩大化生产。经气相色谱—质谱联用技术分离检测培养液中的γ-癸内酯，结果表明分离物的结构、分子量与γ-癸内酯标准品一致(附图5)。解酯耶氏酵母NYL01菌株可为γ-癸内酯的生产提供优良菌种。附图说明图1解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01菌株在固体YPD培养基上培养2d菌落正面。图2解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01细胞显微特征(640×和1600×)。图3解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01菌株ITS基因序列。图4解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01菌株ITS序列与NCBI数据库比对结果。图5解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01菌株转化培养液气相色谱—质谱检测图。图6解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01菌株转化培养液中细胞浓度和γ-癸内酯浓度随时间的变化曲线。保藏声明一株解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M2015696，保藏日期为2015年11月24日。具体实施方式下面对本专利技术具体实施方式做一个详细的说明。实施例1解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01菌株的培养。1培养基1.1YPD培养基：葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母粉1％、水1L，pH5.0～5.5。固体培养基在此基础上添加琼脂粉2％，pH调节至6.0～6.5。1.2转化培养基：葡萄糖2％、酵母粉1％、蓖麻油酸10％、磷酸二氢钾0.05、磷酸氢二钠0.03％、硫酸镁0.01％、吐温0.4％，水1L。pH自然。2实验方法2.1高产γ-癸内酯菌株的分离纯化、筛选以及诱变步骤1：分别从不同土壤样本中称取适量土样，放入装有无菌水的摇瓶中，震荡摇匀片刻，取少量土壤浸出液，用无菌水稀释成不同浓度后，吸取50uL涂布于YPD固体培养基上。28℃培养2d。选择菌落分布均匀，数量适中的平板，挑取不同表型特征的单菌落(包括细菌和真菌)，分别划线于新鲜的YPD固体培养基上进行纯化培养。获得的单菌落再次转接至新鲜的YPD固体培养基进行纯化，获得性状均一的纯菌株。将分离纯化获得的各个菌株编号保存于20％甘油中，置于－20℃冰箱中保存备用。步骤2：将分离纯化获得的菌株接种在YPD固体培养基上活化2d，挑取少量菌落接入YPD液体培养基中扩培，200r/min，28℃摇床培养约16～20h，按10％接种量将种子液接入转化培养基，200r/min，28℃摇床培养约60h。取适量转化液，加入一定量的内标物(桃醛)混匀，再加入等体积的乙酸乙酯抽提(震荡混匀)，离心后取上清液，采用气相色谱法检测γ-癸内酯浓度，筛选产γ-癸内酯的菌株。步骤3：将高产γ-癸内酯的菌株细胞制成原生质体，经紫外线诱变获得突变子，从中筛选高产γ-癸内酯的正突变菌株，筛选获得的高产γ-癸内酯的突变菌株，将其中产量最高的1株送宝生物工程(大连)有限公司做菌种鉴定。3实验结果3.1高产γ-癸内酯菌株的分离纯化、筛选从收集的46份土壤样本中分离纯化获得了包括细菌和真菌在内的总共628株菌(不排除部分菌株为同一株，只是分离纯化时来自不同菌落)，对这628株菌分别进行了产γ-癸内酯能力的测试，其中5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)NYL01菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M 2015696，保藏日期为2015年11月24日。

【技术特征摘要】
1.一株解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCCNO：M2015696，保藏日期为2015年11月24日。2.根据权利要求1所述的解酯耶氏酵母NYL01菌株用于生产γ-癸内酯。3.一种γ-癸内酯的生物转化制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：a.用接种环挑取适量如权利要求1所述的解酯耶氏酵母NYL01菌株菌落，转接于YPD液体培养基，扩增培养16～20h...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯贻安，沈情佳，杨霄，周俊辰，
申请(专利权)人：浙江诺睿特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33