一种电化学发光探针三联吡啶钌-CBT及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种电化学发光探针三联吡啶钌‑CBT及其制备方法与应用，涉及生物检测技术领域。该方法是在CABT上引入活泼氨基，得到活泼氨基‑CBT，用于修饰到三联吡啶钌上；通过氨基、羧基脱水缩合作用将活泼氨基‑CBT修饰到Ru(bpy)3

An electrochemical luminescence probe terpyridyl ruthenium CBT and preparation method and application thereof

Probe terpyridyl ruthenium CBT and its preparation method and the application of the invention discloses an electrochemical luminescence, relates to the technical field of biological detection. This method is the introduction of reactive amino groups in CABT, CBT get lively amino modified, for terpyridyl ruthenium; through dehydration condensation effect of amino and carboxyl active amino CBT modified Ru (bpy) 3

【技术实现步骤摘要】
一种电化学发光探针三联吡啶钌-CBT及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种电化学发光探针三联吡啶钌-CBT(Ru(bpy)32+-CBT)及其制备方法与应用。
技术介绍
蛋白酶是一组能够在特定的活性位点将蛋白质或寡肽酶解成更小碎片的蛋白水解酶。蛋白酶的存在非常丰富，几乎存在于所有的生物体中，这些酶几乎参与生物体所有的生物过程，其活性与许多疾病密切相关，因此蛋白酶常被用作药物治疗的靶点和疾病诊断的标志物。研究发现，蛋白酶在许多生理过程中起着关键性作用，包括蛋白质消化、血管生成、血液凝固、创伤修复、细胞自噬、衰老、坏死、细胞凋亡和DNA遗传信息的传递等生物过程。蛋白酶种类繁多，包含胰蛋白酶、caspase家族蛋白酶、凝血酶、基质金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶等，在体内发挥着各不相同的作用。许多蛋白酶已经成为疾病预测及诊断的生物检测靶点，因此，建立一种高灵敏且通用的蛋白酶活性检测方法，基础科学研究和疾病临床诊断领域具有重要意义。目前，较常见的检测蛋白酶活性的方法有荧光法、比色法、电化学法、化学发光法和电化学发光法等，荧光法应用较早且用途广泛，已经发展得相当成熟，近年来不断有基于荧光法的纳米材料探针用于蛋白酶活性的体外检测和活细胞内实时原位检测的方法报道，但该类纳米探针制备有极强的技术性和很高的成本，严重限制了其临床应用。而比色法的不足之处在于不能达到足够高的灵敏度和稳定性，而且容易受杂质干扰而影响检测的精准度。电化学法具有灵敏度好、准确度高和选择性好的优点，但是多数高灵敏的检测平台多是在前期进行了繁琐的电极修饰，是的该类方法的技术要求较高，且由于通用性不足，间接增加了该类平台的检测成本。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT。本专利技术的再一目的在于提供一种基于电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT检测蛋白酶活性的方法。该方法是一种基于功能化的电化学发光探针自发且特异性的与被蛋白酶切割后的多肽底物组装反应，对蛋白酶进行高灵敏度和高特异性检测的平台。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT的制备方法，包括如下步骤：(1)在CABT(6-氨基-2-氰基苯并噻唑)上引入活泼氨基，得到活泼氨基-CBT，用于修饰到三联吡啶钌上；(2)通过氨基、羧基脱水缩合作用将活泼氨基-CBT修饰到Ru(bpy)32+上，得到电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT。步骤(1)中所述的CABT(6-氨基-2-氰基苯并噻唑)购自上海欧堃化学有限公司。步骤(1)中所述的活泼氨基-CBT优选为glycine-CBT；所述的glycine-CBT合成步骤如下：1)称取Boc-glycine(N-叔丁氧羰基-甘氨酸)和NMM(N-甲基吗啡啉)到THF(四氢呋喃)中；2)在0℃氮气保护条件下加入氯甲酸异丁酯，反应；3)向步骤2)的反应溶液中加入CABT，0℃搅拌反应后，再室温下搅拌反应；4)向步骤3)的反应溶液中加入饱和NaHCO3，再用乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥有机相；5)通过减压旋蒸去除有机相后，利用硅胶柱层析纯化产物，二氯甲烷/甲醇洗脱终产物Boc-glycine-CBT；6)将步骤5)所得产物用二氯甲烷溶解，加入TFA(三氟乙酸)，室温下反应；7)纯化获得glycine-CBT；步骤1)中所述的Boc-glycine和NMM的质量比为7：6；步骤1)中所述的NMM的浓度为7.5mg/mL；步骤2)中所述的氯甲酸异丁酯与NMM的质量比为2：3；步骤2)中所述的反应的条件为0℃反应30min；步骤3)中所述的CABT与Boc-glycine的质量比为1：2；步骤3)中所述的0℃搅拌反应的时间为2h；步骤3)中所述的室温下搅拌反应的时间为12h；步骤5)中所述的二氯甲烷/甲醇中二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1～5:1；步骤6)中所述的TFA的终浓度为20％；步骤6)中所述的室温下反应的时间为12h；步骤(2)中所述的Ru(bpy)32+来自Ru(bpy)2dcbpy(PF6)2，Ru(bpy)2dcbpy(PF6)2合成步骤如下：1)称取0.1g二氯双(2,2′-联吡啶)钌、0.1gNaHCO3和0.075g4,4′-二羧酸-2,2′-联吡啶，80℃搅拌回流反应10h。2)冰浴2h后，用1M硫酸调节pH值至4.4，滤纸过滤除去未反应的4,4′-二羧酸-2,2′-联吡啶，用2～3mL甲醇进一步冲洗滤纸。3)向上述滤液中加入6.25mLNaPF6溶液，室温下搅拌反应2h，用1M硫酸调节pH值至4，冰浴4h。4)4℃5000rpm离心5min，收集析出晶体，冻干干燥产物，得到Ru(bpy)2dcbpy(PF6)2。5)称取230mgDCC和120mgNHS搅拌溶解于2mL无水DMF中，然后置于冰上。6)向上述混合物中加入190mg三联吡啶钌，于冰水浴中搅拌反应30min，在室温反应5h。7)于5000g，4℃离心5min，弃去沉淀，得到Ru(bpy)2dcbpy-NHS溶液。步骤(2)所述的将活泼氨基-CBT修饰到Ru(bpy)2dcbpy(PF6)2上的反应步骤及体系如下：a)取23.3mg活泼氨基-CBT缓慢加入到1.5mLRu(bpy)2dcbpy-NHS溶液中，室温搅拌反应12h。b)向上述反应体系中加入100mL去离子水，用10×100mL乙酸乙酯萃取产物，并用无水Na2SO4干燥。c)通过减压旋蒸去除有机相后，利用硅胶柱层析纯化产物，二氯甲烷/甲醇(二氯甲烷：甲醇＝5：1～1：1)洗脱终产物Ru(bpy)32+-CBT。一种电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT，通过上述制备方法制备得到。所述的电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT在检测蛋白酶活性中的应用。一种基于电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT检测蛋白酶活性的方法，包括如下步骤：(Ⅰ)多肽底物与待检蛋白酶样品共孵育，然后加入蛋白酶抑制剂终止酶切反应，得到蛋白酶切产物CK-Biotin；所述的多肽底物序列模式为XXXXCK-Biotin，XXXX为蛋白酶特异性识别序列，多肽底物在被蛋白酶切割后会产生一个二肽Cys-Lys-Biotin；(Ⅱ)电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT与蛋白酶切产物CK-Biotin组装反应，生成组装复合物Ru(bpy)32+-CBT-CK-Biotin；(Ⅲ)利用链霉亲和素包被的磁珠富集、分离复合物Ru(bpy)32+-CBT-CK-Biotin；(Ⅳ)对步骤(Ⅲ)分离得到的Ru(bpy)32+-CBT-CK-Biotin进行电化学发光分析，从而间接反映蛋白酶的催化量。步骤(Ⅰ)中所述的蛋白酶需要具备这一特点：其所识别的多肽底物的序列是特异的，且允许在酶切位点碳末端一侧设计一个半胱氨酸。步骤(Ⅰ)中所述的多肽底物工作浓度优选为1μM。步骤(Ⅱ)中所述的电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT与酶切产物CK-Biotin组装反应的条件优选为：室温下温和震荡反应15～60min本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种电化学发光探针Ru(bpy)3

【技术特征摘要】
1.一种电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)在CABT上引入活泼氨基，得到活泼氨基-CBT，用于修饰到三联吡啶钌上；(2)通过氨基、羧基脱水缩合作用将活泼氨基-CBT修饰到Ru(bpy)32+上，得到电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT。2.根据权利要求1所述的电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的活泼氨基-CBT为glycine-CBT。3.根据权利要求1所述的电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的Ru(bpy)32+来自Ru(bpy)2dcbpy(PF6)2。4.一种电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT，其特征在于通过权利要求1～3任一项所述的制备方法制备得到。5.权利要求4所述的电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT在检测蛋白酶活性中的应用。6.一种基于电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT检测蛋白酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：(Ⅰ)多肽底物与待检蛋白酶样品共孵育，然后加入蛋白酶抑制剂终止酶切反应，得到蛋白酶切产物CK-Biotin；所述的多肽底物序列模式为XXXXCK-Biotin，XXXX为蛋白酶特异性识别序列，多肽底物在被蛋白酶切割后会产生一个二肽Cys-Lys-Biotin；(Ⅱ)电化学发光探针Ru(bpy)32+-CBT与蛋白酶切产物CK-Biotin组装反应，生成组装复合物Ru(bpy)32+-CBT-...

【专利技术属性】
技术研发人员：周小明，邢达，程猛，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44