一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法，包括如下步骤：(1)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入台盼蓝混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至(2‑10)×10

【技术实现步骤摘要】
一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法及应用
本专利技术属于生物制品质量检测分析领域，涉及一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法及应用。
技术介绍
血管内皮生长因子(VEGF)是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生，促进血管再生，目前广泛应用于肿瘤药物的评价检测中，其本身质量的好坏直接关系到药物活性检测结果的准确性。目前市面上VEGF产品的质量参差不齐，批次间存在较大的差异，主要是因为不当的保存条件与使用方法严重影响了VEGF产品的生物学活性。因此，为保证不同的VEGF产品具有相近的生物学活性，有必要建立一种VEGF产品的活性控制与检测方法。VEGF具有促进细胞增殖的能力，其生物学活性的评价主要通过检测细胞代谢或DNA合成来完成。如在MTT比色法和CCK8比色法中，化学试剂被活细胞线粒体脱氢酶还原后生成贾瓒产物，生成的贾瓒产物的量与活细胞的数量成正比，利用这一特性可检测活细胞的数量，从而间接检测细胞生长因子的生物学活性。201611195041.6公开了肝素寡糖制备抑制细胞异常增殖药物的新用途，该专利技术使用MTT法确定VEGF对细胞增殖的影响；201710本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入台盼蓝混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至(2‑10)×10

【技术特征摘要】
1.一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入台盼蓝混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至(2-10)×104/mL；(2)将调整后的细胞在CO2培养箱中培养3-10h；(3)将内皮生长因子作浓度梯度稀释，向步骤(2)中培养后的细胞中加入各梯度稀释的血管内皮生长因子溶液，混匀后在CO2培养箱中培养80-100h；(4)向步骤(3)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入阿尔玛蓝显色液，混匀后在CO2培养箱中培养1-10h；(5)将步骤(4)培养后的样品进行荧光强度的检测。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述台盼蓝反应的质量浓度为0.1-3％，优选为0.4％；优选地，步骤(1)所述细胞浓度为(4-8)×104/mL；优选地，步骤(2)所述培养的温度为35-40℃，优选为37℃；优选地，步骤(2)所述培养的CO2浓度为3-8％，优选为5％；优选地，步骤(2)所述培养的时间为4-8h，优选为5-7h。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，在步骤(3)加入所述待检测的血管内皮生长因子溶液前还包括将所述待检测的血管内皮生长因子溶液进行稀释的步骤；优选地，所述待检测的血管内皮生长因子溶液稀释后的浓度从500ng/ml至1ng/ml；优选地，所述稀释浓度从500ng/ml至1ng/ml选取9个浓度；优选地，所述选取的9个浓度为500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.7ng/ml、7.9ng/ml、4ng/ml和2ng/ml；优选地，步骤(3)所述培养的温度为35-40℃，优选为37℃；优选地，步骤(3)所述培养的CO2浓度为3-8％，优选为5％；优选地，步骤(3)所述培养的时间为85-95h，优选为88-92h。4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)所述阿尔玛蓝与所述混合液的体积比为1:(2-8)，优选为1:4；优选地，步骤(4)所述培养的温度为35-40℃，优选为37℃；优选地，步骤(4)所述培养的CO2浓度为3-8％，优选为5％；优选地，步骤(4)所述培养的时间为2-8h，优选为3-5h；优选地，步骤(5)所述检测的条件为在激发光530nm和发射光590nm下进行。5.根据权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括细胞培养的步骤；优选地，所述细胞培养的步骤包括：进行细胞培养和细胞消化，收集得到所述细胞；优选地，所述细胞培养具体包括：将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期；优选地，所述细胞消化具体包括：向培养到对数生长期的细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，吹打混匀并收集至离心管中；优选地，所述胰蛋白酶溶液的质量浓度为0.1-3％，优选为0.25％。6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期，向细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，反应浓度为0.1-3％吹打混匀并收集至离心管中；(2)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中台盼...

【专利技术属性】
技术研发人员：张妍，孙菁，相凤阳，程欣，张贵亚，
申请(专利权)人：东曜药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32