The present invention provides a hybrid genome sequencing of the target region capture method, including primer design and synthesis, library construction and hybrid capture steps of hybrid capture is optimized, simple operation, incubation time is moderate, can be used for the DNA library from various sources, effectively reduce the capture cost, improve the capture efficiency, shorten the test time suitable for the target region, genome sequencing.
【技术实现步骤摘要】
一种基因组目标区域测序的杂交捕获方法
本专利技术涉及基因测序领域,具体涉及一种基因组目标区域测序的杂交捕获方法。
技术介绍
在二代测序中,常需要对特定基因组目标区域测序。目标区域测序,比较常用的方法利用RNA探针捕获富集感兴趣的目标基因或基因组区域的DNA片段,以提高测序的深度、准确性和灵敏度。由于DNA捕获探针被设计成能够与靶标区域相杂交互补的性质,使得目标片段的富集依赖于核苷酸的物理及化学性质,比如二级结构、退火温度、核苷酸浓度以及GC含量及盐浓度等。基于杂交富集的原理,通常通过提高孵育的时间来提高特异性,通常的孵育时间在10-72小时,甚至更长。而长时间的孵育明显影响测序的进程。另外,较高的孵育温度以及长时间的孵育将会影响混合液中的盐离子浓度,尤其是当杂交反应的体积较小的时候。虽然现在很多测序公司已经能够提供商品化的杂交富集方法及相应的试剂盒,但是其杂交方法多针对于本公司所生产的探针,其捕获探针通常不公开,且试剂溶液价格昂贵。每种试剂盒的操作条件均不相同,存在较大的差异,且文库的输入量有严格要求。因而很有必要提供一种重复性高,操作时间短,高特异性,同时能够适用多种方法构建的基因组文库及捕获探针的杂交溶液及方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于针对现有技术中杂交富集溶液昂贵、使用有局限,提供一种用于基因组目标区域测序的杂交捕获方法。为实现上述目的,本专利技术采用如下技术方案:一种基因组目标区域测序的杂交捕获方法,包括如下步骤:(一)探针设计合成根据基因组目标区域,以已知基因组序列为参考,以瓦片阵列的方式设计生成探针群,探针长度为100~120bp,并过滤 ...
【技术保护点】
一种基因组目标区域测序的杂交捕获方法,其特征在于,包括如下步骤:(一)探针设计合成根据基因组目标区域,以已知基因组序列为参考,以瓦片阵列的方式设计生成探针群,探针长度为100~120bp,并过滤掉高度重复探针,在探针两段加入通用引物,并合成作为探针模板,以此模板体外转录制备参入生物素标记核苷酸的探针;(二)文库构建按照插入片段大小为200~300bp构建DNA文库,文库浓度不低于15ng/μl;(三)杂交捕获1)分别配置文库混合液、杂交混合液和捕获混合液;2)PCR仪设定如下程序:95℃,5min;65℃,3min;65℃,2min;65℃,∞;3)放入文库混合液,开始程序第一步:95℃5min;4)到程序第二步65℃3min时,立即将杂交混合液放入;5)到程序第三步65℃2min时,立即将捕获混合液放入;6)到程序第四步后,在PCR仪上,将文库混合液、杂交混合液与捕获混合液混合;7)65℃杂交36个小时;8)用磁珠捕获步骤7)的杂交产物;其中,文库混合液含Human cot‑1、通用寡核苷酸、步骤(二)构建的文库和文库对应的blocker序列其中,杂交混合液由SSPE、EDTA、De ...
【技术特征摘要】
1.一种基因组目标区域测序的杂交捕获方法,其特征在于,包括如下步骤:(一)探针设计合成根据基因组目标区域,以已知基因组序列为参考,以瓦片阵列的方式设计生成探针群,探针长度为100~120bp,并过滤掉高度重复探针,在探针两段加入通用引物,并合成作为探针模板,以此模板体外转录制备参入生物素标记核苷酸的探针;(二)文库构建按照插入片段大小为200~300bp构建DNA文库,文库浓度不低于15ng/μl;(三)杂交捕获1)分别配置文库混合液、杂交混合液和捕获混合液;2)PCR仪设定如下程序:95℃,5min;65℃,3min;65℃,2min;65℃,∞;3)放入文库混合液,开始程序第一步:95℃5min;4)到程序第二步65℃3min时,立即将杂交混合液放入;5)到程序第三步65℃2min时,立即将捕获混合液放入;6)到程序第四步后,在PCR仪上,将文库混合液、杂交混合液与捕获混合液混合;7)65℃杂交36个小时;8)用磁珠捕获步骤7)的杂交产物;其中,文库混合液含Humancot-1、通用寡核苷酸、步骤(二)构建的文库和文库对应的blocker序列其中,杂交混合液由SSPE、EDTA、Denharts溶液及SDS混合制成;其中,捕获混合液为含步骤(一)所述探针和RNase抑制剂的溶液。2.根据权利要求1所述的杂交捕获方法,其特征在于,其中步骤(二)构建文库进行的PCR循环数不超过9次。3.根据权利要求1所述的杂交捕获方法,其特征在于,所述文库混合液的配置方法如下:在1.5mLEP管中加入:Humancot-15μl、500μMUniversaloligo2μl、1-8种DNA文库每个文库200ng,各DNA文库对应的blocker200μM各1μl,盖上后,用注射器针头在盖上扎3-5个孔,65℃离心真空干燥至看不见明显液滴,12000rpm离心2min,打开盖,底部加入8μl水,盖上盖,用封口膜将盖子上的孔封住,涡旋,12000,2min,并转移到PCR管。4.根据权利要求1所述的杂交捕获方法,其特征在于,所述杂交混合液的配置方法如下:4*SSPE20μl、...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。