用于基因组目标区域捕获测序的杂交富集溶液及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于基因组目标区域捕获测序的杂交富集溶液和试剂盒，所述杂交富集溶液由SSPE、EDTA、Denharts溶液及SDS组成。本发明专利技术公开的改进的杂交富集溶液配方简单，成本较低且容易保存，能够特异性的提取目标DNA片段，适合第二代测序中的捕获杂交富集基因组目标区域的操作。

Hybridization enrichment solution and kit for genomic target region capture sequencing

The present invention provides a hybrid enrichment solution and kit for genomic target region capture sequencing. The hybridization enrichment solution consists of SSPE, EDTA, Denharts solution and SDS. The invention discloses a hybrid improved enrichment solution is simple, low cost and easy to save, it can extract target specific DNA fragments for the second generation sequencing of genomic hybridization capture operation enrichment of target area.

【技术实现步骤摘要】
用于基因组目标区域捕获测序的杂交富集溶液及试剂盒
本专利技术涉及基因测序领域，具体涉及一种用于基因组目标区域捕获测序的杂交富集溶液以及试剂盒。
技术介绍
在二代测序中，常需要对特定基因组目标区域测序。目标区域测序，比较常用的方法利用RNA探针捕获富集感兴趣的目标基因或基因组区域的DNA片段，以提高测序的深度、准确性和灵敏度。由于DNA捕获探针被设计成能够与靶标区域相杂交互补的性质，使得目标片段的富集依赖于核苷酸的物理及化学性质，比如二级结构、退火温度、核苷酸浓度以及GC含量及盐浓度等。基于杂交富集的原理，通常通过提高孵育的时间来提高特异性，通常的孵育时间在10-72小时，甚至更长。而长时间的孵育明显影响测序的进程。另外，较高的孵育温度以及长时间的孵育将会影响混合液中的盐离子浓度，尤其是当杂交反应的体积较小的时候。虽然现在很多测序公司已经能够提供商品化的杂交富集溶液及相应的试剂盒，但是其杂交溶液及方法多针对于本公司所生产的探针，其捕获探针通常不公开，且试剂溶液价格昂贵。每种试剂盒的操作条件均不相同，存在较大的差异，且文库的输入量有严格要求。因而很有必要提供一种重复性高，操作时间短，高特异性，同时能够适用多重方法构建的基因组文库及捕获探针的杂交溶液及方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于针对现有技术中杂交富集溶液昂贵、使用有局限，提供一种用于基因组目标区域捕获测序的杂交富集溶液。本专利技术的另一个目的在于提供一种用于基因组目标区域驳火测序的试剂盒为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种用于基因组目标区域捕获测序的杂交富集溶液，所述溶液包括SSPE、EDTA、Denharts溶液及SDS。具体地，所述溶液可由SSPE、EDTA、Denharts溶液及SDS混合制成。优选地，所述溶液每36.8μl中含：4×SSPE20μl、0.1MEDTA0.8μl、50×Denharts溶液8μl、0.1％SDS8μl。其中，所述EDTA的pH值为8.0。一种用于基因组目标区域捕获测序的试剂盒，其包括所述的杂交富集溶液。进一步，所述试剂盒还可包括结合缓冲液、洗涤缓冲液中的一种或多种。其中，所述结合缓冲液的配置为每50ml含：5MNaCl13ml，1MpH7.5Tris-HCI缓冲液2ml，0.5MpH8EDTA缓冲液0.01ml，余量为水；其中，所述洗涤缓冲液包括洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2，洗涤缓冲液1的配置为每50ml含：20×SSC2.8ml，10％SDS溶液1ml，余量为水；其中，所述洗涤缓冲液2的配置为每100ml含：20×SSC3ml，10％SDS溶液0.1ml，余量为水。优选地，所述试剂盒还进一步包括blocker探针序列。所述blocker探针序列包括但不限于选自SEQIDNO:1-96中的序列。本专利技术杂交溶液配方简单，成本较低且容易保存。本专利技术试剂盒能够有效应用于第二代捕获测序，大大降低捕获成本，提高捕获效率，缩短实验时间。附图说明图1杂交捕获示意图。具体实施方式下面结合附图，详细说明本专利技术的实施操作，但本专利技术请求保护的技术方案不受限于下述实施方式，在不改变其要点的情况下，可做各种改变进行实施。其中实施例中使用的试剂，如果没有特别说明，在满足实验要求的情况下，均购自试剂公司。实施例中涉及的试剂及材料：实施例1试剂配制与存储以下试剂配制所用水均为无核酸水，所用容器也需进行去核酸酶处理后才能使用。1)Note#14*SSPE(ivitrogen，15591043)，分装于1.5ml管中，保存于4度。2)Note#20.1MEDTA，pH8.0(ivitrogen，15575020)，分装于1.5ml管中，保存于4度。3)Note#350*denharts(invitrogen,750018)，分装于1.5ml管中，保存于-20度。4)Note#40.1％SDS(invitrogen,15553027),稀释到1×，分装于1.5ml管中，保存于4度。5)结合缓冲液(Bindingbuffer)：组成：NaCl，Tris-HCl，EDTA，pH7.5配制：6)洗涤缓冲液1(WashBuffer1)：组成：SSC,SDS配制：7)洗涤缓冲液2(WashBuffer2)：组成：SSC,SDS配制：oligo准备用PAGE纯化方式合成以下oligo，用水将oligo干粉溶解到存储浓度，然后*：与barcode序列反向互补，见下表1表1：blocker序列实施例2panel的设计与定制1.目标区域列表的生成a)根据实验的设计,选择想要测序的区域，以hg19为参考基因组，建立目标区域列表，含染色体编号及起始点位置；b)目标区域调整：目标区域小于220bp的，向两端延伸到220bp。2.评估目标区域(targetregion)的GC含量对于GC含量高于70％或低于30％的区域，多设计1×到2×tiling的探针设计。3.探针的生成a)以瓦片阵列(tilingarray)方式生成长度为110bp的探针群，即按照一定的重叠程度有规律地截取基因组的序列作为探针序列(如2×tiling设计，间隔长度为55bp；3×tiling设计，间隔长度为37bp)；b)对于GC含量高于70％或低于30％的区域，多设计1×到2×tiling的探针设计；c)探针到目标区域末端时直接跨出区域设计。4.过滤高度重复区的探针参考过滤条件：所有探针blast到基因组(没加接头)，过滤掉高重复(30％match，80％indentity)的探针，repeat>15滤掉。5.通用引物序列加入探针的两端加上下一步用于PCR的通用引物序列，探针结构如下：GAAGCGAGGATCAACT(N110)CATTGCGTGAACCGA。6.芯片定制将探针列表交由探针合成公司合成(可选择公司如CustomArray、MYcroarray等)，返回的即为洗脱下来的探针溶液。注意事项:1)根据Panel的大小与检测目的的不同，选择不同的tiling的探针设计，以2×至4×为佳。2)GC含量高于70％或低于30％的区域，即使多设计1×，实际实验结果也可能欠佳。3)内含子区域或者其他非编码区，可能重复序列较高，或GC含量较低，这些区域捕获测序效果可能欠佳。实施例3探针的制备本实施例介绍探针的制备、存储。本章实验所需耗材需为无核酸耗材，全程戴手套、口罩，在超净台操作。1.探针模板制备1)先取5μl探针原液，用10mMTris-HClbuffer稀释到3ng/μl,，4.2μl/管分装，取一管继续下面的步骤，其余冻存于-80度；2)按以下体系及程序，平行做2管；反应体系：KAPAHIFIlibraryamplificationKit25μlRev(25μM)1μlSP6promoter(25μM)1μlOligopool(稀释后)1μl水22μl反应程序：3)qubit定量：取1μlPCR产物进行qubit定量，确定2管皆有PCR产物，继续下面步骤；注：浓度大概在10-20ng/μl，但不同panel会有差异，可在此步骤做几次重复实验，统计平均数及偏差，作为一个质控点.4)2管合并到一起，用QIAquickPCRcleanKit纯化，用50μl水(碱性)溶；5)Qubit定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于基因组目标区域捕获测序的杂交富集溶液，其特征在于，所述溶液包括SSPE、EDTA、Denharts溶液及SDS。

【技术特征摘要】
1.一种用于基因组目标区域捕获测序的杂交富集溶液，其特征在于，所述溶液包括SSPE、EDTA、Denharts溶液及SDS。2.如权利要求1所述的溶液，其特征在于，所述溶液由SSPE、EDTA、Denharts溶液及SDS混合制成。3.如权利要求2所述的溶液，其特征在于，所述溶液每36.8μl中含：4×SSPE20μl、0.1MEDTA0.8μl、50×Denharts溶液8μl、0.1％SDS8μl。4.如权利要求2-3任一权利要求所述的溶液，其特征在于，所述EDTA的pH值为8.0。5.一种用于基因组目标区域捕获测序的试剂盒，其包括权利要求1-4任一项所述的杂交富集溶液。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括结合缓冲液、洗涤缓冲液中的一种或多种。7.根据权利要求6所述的试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彦伟，
申请(专利权)人：张彦伟，
类型：发明
国别省市：北京,11