盐生草耐盐基因HgS3及其应用制造技术

本发明专利技术涉及从盐生植物盐生草中分离的一个耐盐基因HgS3及其应用。其目的在于提供一个新的耐盐基因HgS3及其编码蛋白与其在提高植物耐盐性和培育耐盐新品种(系)中的应用。耐盐基因HgS3包含如SEQ ID NO.1cDNA的核苷酸序列，分子量为468bp，其cDNA编码序列为SEQ ID NO.1中第208至第336位所述的核苷酸序列，分子量为129bp，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3，由42个氨基酸组成，该基因能够显著提高转基因拟南芥幼苗的耐盐特性。本发明专利技术所述的耐盐基因将有助于耐盐植物(作物)新品系(种)的培育。

Salt tolerance gene HgS3 of halophyte and its application

The present invention relates to a salt tolerant gene HgS3 isolated from halophyte halophytes and its application. The aim is to provide a new salt tolerant gene HgS3 and its coding protein and its application in improving salt tolerance and breeding new salt tolerant varieties (lines) in plants. Salt tolerance gene HgS3 contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1cDNA, molecular weight of 468bp, cDNA sequences encoding the nucleotide sequence of 208th to 336th of the SEQ ID NO.1, molecular weight is 129bp. The amino acid sequence of SEQ ID NO.3, 42 amino acids from the base because can significantly improve the salt tolerance of transgenic Arabidopsis seedlings. The salt tolerant gene described in this paper will be helpful for the cultivation of new salt tolerant plants (crops).

【技术实现步骤摘要】
盐生草耐盐基因HgS3及其应用
本专利技术属于植物生物工程和转基因
，具体涉及盐生植物盐生草耐盐基因及其在提高植物耐盐性中的应用。
技术介绍
土壤盐渍化是影响作物生长和产量的最主要非生物胁迫之一。随着全球气候的逐渐变暖，更是加剧了土壤盐渍化进程，尤其是针对我国西北广大旱区和半干旱地区来讲，原本极为有限的降雨量进一步减少，蒸发进一步的加强，致使土壤盐渍化形势更加严峻，且由于传统农业过度灌溉，只灌不排，更是让大面积宝贵的可耕作土地资源被盐渍化所吞噬，最终不得不被农业生产所抛弃，逐渐演变成荒漠化和沙漠化土地。因此，提高植物(作物)耐盐性，使得植物(作物)能够在这些荒废的盐渍地上生长，做到充分利用和有效改良这些盐渍土壤对保障我国粮食安全和改善生态环境，实现农业可持续发展具有重要意义。我国西北地区广泛分布着多种耐盐植物，这些植物对当地严酷的自然环境形成了良好的适应性，从耐盐植物(作物)培育的角度来考虑，这些植物是宝贵的耐盐基因发掘优异材料。而关于西北旱区本土盐生植物耐盐基因发掘的研究较少，尤其是抗盐先锋植物盐生草(Halogetonglomeratus)，从中发掘优异耐盐基因对培育耐盐植物(作物)材料具有重要的运用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种盐生草耐盐基因HgS3，以应对当前对优良耐盐基因的需求。本专利技术的又一目的在于提供了一种盐生草耐盐基因HgS3的制备方法，从而实现高效、快速获得该基因。本专利技术的还一目的在于提供了一种所述的盐生草耐盐基因HgS3在提高植株耐盐性的应用。本专利技术依据前期盐生草盐胁迫响应转录组学测序结果(Transcriptomicprofilingofthesalt-stressresponseinthehalophyteHalogetonglomeratus[J].BMCgenomics,2015,16(1):169)，筛选鉴定到盐胁迫诱导表达基因HgS3，进一步在盐生草叶片中分离出HgS3基因，并将该基因连接到超表达载体pCAMBIA3300上，而后通过农杆菌浸染法转化拟南芥，连续抗生素Kan筛选，获得T2代转基因纯系，经幼苗耐盐性分析证实，HgS3基因能够显著提高拟南芥植株的耐盐性。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种盐生草耐盐基因HgS3，其主要特点在于从盐生草叶片中分离得到的HgS3基因的核苷酸序列SEQIDNO.1如下，分子量468bp:所述的盐生草耐盐基因HgS3，其特征在于所述的基因cDNA编码序列为分离到的HgS3基因的核苷酸序列中第208至第336位所述的核苷酸序列SEQIDNO.2如下，分子量为219bp：所述的盐生草耐盐基因HgS3，所述的基因cDNA编码序列的基因编码蛋白氨基酸序列SEQIDNO.3，由42个氨基酸组成：所述的盐生草耐盐基因HgS3，其特异引物为：HgS3-F1为5’-AAAAGACACTCCATAATCTTGTGTT-3’，HgS3-R1为5’-TTTTATTGATGCAAATAAGCTACTA-3’。由上海生工生物工程公司合成。所述的盐生草耐盐基因HgS3的制备方法，其主要特点在于步骤为：以200-500mMNaCl处理3-7d的盐生草幼苗叶片组织为材料，用Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA第一链，扩增所述基因片段，PCR反应体系为5×PrimeSTARBuffer5μL，dNTPMixture(各2.5mM)2μL，上游引物F15’-AAAAGACACTCCATAATCTTGTGTT-3’(10μM)1μL，下游引物R15’-TTTTATTGATGCAAATAAGCTACTA-3’(10μM)1μL，cDNA1μL，PrimeSTARHSDNA聚合酶0.25μL，超纯水14.75μL，总体积25μL；扩增程序为94℃预变性4min，94℃50s，60-60.4℃15-20s，72℃1min，共32-35个循环，72℃延伸7-8min，扩增结果如图1所示；利用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司)回收PCR产物，按照说明书步骤：首先用琼脂糖凝胶检测目的片段大小，用灭菌刀片切开含有目的基因的胶块，并装入1.5mL离心管中；对切下的胶块称重，根据1mg＝1μL的比例将重量换算其体积，然后加入3倍体积的BufferGM用于融化胶块，融化过程中振荡或吸打使其充分融化；将Spin柱置于收集管，然后将所有胶块融化液转至Spin柱里，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液；加700μLBufferWB于Spin柱且静置5min后，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液，重复上一步骤；将空Spin柱放在收集管上，室温离心12000rpm，1min，放置2min；再将Spin柱放入新离心管上，在膜中央加20-30μL灭菌超纯水，放置1min；室温12000rpm，离心1min，用于洗脱DNA，最后吸取2-3μL用于电泳检测，其它产物-20℃保存；接着将回收产物与pMD19-T载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS3，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落PCR鉴定，电泳检测含有目标条带的菌液送上海生工生物工程公司进行测序。所述的盐生草耐盐基因HgS3的表达载体的构建方法，其步骤为：在所述的盐生草耐盐基因HgS3的上下游引物上分别添加BamHI和SacI这两个酶切位点，上游引物F1为5’-CGGGATCCAAAAGACACTCCATAATCTTGTGTT-3’、下游引物R1为5’-CGAGCTCTTTTATTGATGCAAATAAGCTACTA-3’:以200-500mMNaCl处理3-7d的盐生草幼苗叶片组织为材料，用Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA第一链，扩增所述基因片段，PCR反应体系为5×PrimeSTARBuffer5μL，dNTPMixture(各2.5mM)2μL，上游引物F15’-CGGGATCCAAAAGACACTCCATAATCTTGTGTT-3’(10μM)1μL，下游引物R15’-CGAGCTCTTTTATTGATGCAAATAAGCTACTA-3’(10μM)1μL，cDNA1μL，PrimeSTARHSDNA聚合酶0.25μL，超纯水14.75μL，总体积25μL；扩增程序为94℃预变性4min，94℃50s，60-60.4℃15-20s，72℃1min，共32-35个循环，72℃延伸7-8min；利用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司)回收PCR产物，按照说明书步骤：首先琼脂糖凝胶检测目的片段大小，用灭菌刀片切开含有目的基因的胶片，并装入1.5mL离心管中；对切下的胶块称重，根据1mg＝1μL的比例将重量换算其体积，然后加3倍体积的BufferGM用于融化胶块，融化过程中适当振荡或吸打使其充分融化；将Spin柱置于收集管，然后将所有胶块融化液转至Spin柱里，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液；加700μLBufferWB于Spin柱且静置5min后，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液，重复上一步骤；将空Spin柱放在收集管上，室温离心12000rpm，1min本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种盐生草耐盐基因HgS3，其特征在于从盐生草叶片中分离到的HgS3基因的核苷酸序列如下，分子量468bp:

【技术特征摘要】
1.一种盐生草耐盐基因HgS3，其特征在于从盐生草叶片中分离到的HgS3基因的核苷酸序列如下，分子量468bp:。2.如权利要求1所述的盐生草耐盐基因HgS3，其特征在于所述的盐生草耐盐基因HgS3的编码序列为权利要求1中第208至第336位所述的核苷酸序列，分子量为129bp：。3.如权利要求2所述的盐生草耐盐基因HgS3，其特征在于所述的盐生草耐盐基因HgS3编码序列的蛋白氨基酸序列，由42个氨基酸组成：。4.如权利要求1所述的盐生草耐盐基因HgS3，其特征在于特异引物为：HgS3-F1为5’-AAAAGACACTCCATAATCTTGTGTT-3’，HgS3-R1为5’-TTTTATTGATGCAAATAAGCTACTA-3’。5.如权利要求1所述的盐生草耐盐基因HgS3的制备方法，其特征在于步骤为：以200-500mMNaCl处理3-7d的盐生草幼苗叶片组织为材料，用Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA第一链，扩增所述基因片段，PCR反应体系为5×PrimeSTARBuffer2.5mM5μL，dNTPMixture2.5mM2μL，上游引物F15’-AAAAGACACTCCATAATCTTGTGTT-3’10μM1μL，下游引物R15’-TTTTATTGATGCAAATAAGCTACTA-3’10μM1μL，cDNA1μL，PrimeSTARHSDNA聚合酶0.25μL，超纯水14.75μL，总体积25μL；扩增程序为94℃预变性4min，94℃50s，60-60.4℃15-20s，72℃1min，共32-35个循环，72℃延伸7-8min；利用胶回收试剂盒回收PCR产物，按照说明书步骤：首先用琼脂糖凝胶检测目的片段大小，用灭菌刀片切开含有目的基因的胶块，并装入1.5mL离心管中；对切下的胶块称重，根据1mg＝1μL的比例将重量换算其体积，然后加入3倍体积的BufferGM用于融化胶块，融化过程中振荡或吸打使其充分融化；将Spin柱置于收集管，然后将所有胶块融化液转至Spin柱里，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液；加700μLBufferWB于Spin柱且静置5min后，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液，重复上一步骤；将空Spin柱放在收集管上，室温离心12000rpm，1min，放置2min；再将Spin柱放入新离心管上，在膜中央加20-30μL灭菌超纯水，放置1min；室温12000rpm，离心1min，用于洗脱DNA，最后吸取2-3μL用于电泳检测，其它产物-20℃保存；接着将回收产物与pMD19-T载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS3，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落PCR鉴定，电泳检测含有目标条带的菌液进行测序。6.如权利要求1所述的盐生草耐盐基因HgS3的表达载体的构建方法，其特征在于步骤为：在所述的盐生草耐盐基因HgS3的上下游引物上分别添加BamHI和SacI这两个酶切位点，上游引物F1为5’-CGGGATCCAAAAGACACTCCATAATCTTGTGTT-3’、下游引物R1为5’-CGAGCTCTTTTATTGATGCAAATAAGCTACTA-3’:以200-500mMNaCl处理3-7d的盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪军成，王化俊，姚立蓉，李葆春，孟亚雄，马小乐，任盼荣，司二静，杨轲，邹兰，闫栋，张燕，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62