一个烟草阳离子/氯离子共转运基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及烟草氯离子转运相关基因，特别是涉及一个烟草阳离子/氯离子共转运基因

A tobacco cationic / chloride co transporter gene and its application

The present invention relates to tobacco chloride transport related genes, in particular to a tobacco cationic / chloride ion co transport gene

【技术实现步骤摘要】
一个烟草阳离子/氯离子共转运基因及其应用
本专利技术涉及烟草氯离子转运相关基因，特别是涉及一个烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC在盐碱地土壤改良上的应用。
技术介绍
目前，土壤盐碱化已成为一个全球性的问题。盐碱地是各种盐土和碱土以及不同程度盐化和碱化土壤的总称。由于土体中含有大量盐碱成分，并具有不良理化性质，知识植物生长受到抑制，甚至不能生长。根据联合国教科文组织和粮农组织不完全统计，全世界盐碱地的面积为9.54亿公顷，我国约为9900万公顷，居世界第三位，而目前已开垦种植的烟碱土仅有六分之一。此外，我国耕地中盐碱化面积约占耕地总面积的6.62%。作为我国重要的后备耕地资源，改良和利用盐碱地对补偿日益减少的耕地面积、保障国家粮食安全具有重要意义。盐碱化的土壤中，由于土体中含有大量盐碱成分，土壤理化性质也常常不良，进而导致植物生长受到抑制，甚至不能生长。植物在盐碱地上不容易生长是因为植物通过根吸收水分和养料，也会把盐碱成分（主要为氯离子和钠离子）运输到整个植物体。如果吸收到体内的盐碱成分浓度过高，植物就会死去。为改良和开发利用盐碱地，培育能够在盐碱地上正常生长的植物，特别是筛选和培育新的高耐盐性的植物新品种，是进行盐碱地改良的主要出路。现有技术中，通过基因工程筛选和开发新的耐盐基因，并通过基因工程技术培育新的耐盐植物新品种是一个重要的研究途径，并且已经有一定数量的耐盐基因得到了初步研究和应用，但由于盐碱地类型多样，因而所需要的植物类型和耐盐基因也是多样的，筛选和开发新的耐盐基因仍然具有十分重要的研究和应用意义。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一个新的烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC（Cation-chloridecotransporter，CCC），从而为培育耐盐植物新品种、富集土壤中氯离子并最终改良土壤奠定基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一个烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC，包括1113bp个碱基，该基因来源于烟草（Nicotianatabacum），与氯离子转运相关，其碱基序列如SEQIDNO.1所示；其中第5位-477位核苷酸为特异性核酸片段。烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC所编码共转运蛋白，包括370个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC所编码共转运蛋白在烟草中的应用，用于转运氯离子。所述烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC在烟草中的应用，将该基因沉默后，植物体内氯离子可以得到富集。用于沉默烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC的瞬时沉默VIGS载体，构建方法为：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术，以所述烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC的特异性核苷酸片段作为引导序列，将特异性核酸片段接到瞬时表达载体TRV上，转化大肠杆菌DH5α，从而构建获得瞬时表达载体TRV-NtCCC。所述用于瞬时沉默烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC的VIGS载体在烟草中的应用，用于沉默烟草中阳离子/氯离子共转运基因NtCCC，沉默共转运基因NtCCC后，植物体中氯离子含量得到积累。利用所述用于沉默烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC的VIGS载体所构建的NtCCC瞬时沉默植物新品种的方法，利用病毒诱导的基因沉默技术，将瞬时沉默载体TRV-NtCCC转化本氏烟后，筛选、鉴定获得阳离子/氯离子共转运基因NtCCC瞬时沉默植株，相较于未沉默植株，NtCCC基因沉默植株中氯离子含量得到明显富集。所述阳离子/氯离子共转运基因NtCCC瞬时沉默植物新品种在盐碱地土壤改良中的应用，植株可以积累、富集土壤中氯离子，从而改良土壤。本专利技术中烟草中阳离子/氯离子共转运基因NtCCC是烟草氯离子代谢的关键调控基因，通过real-timePCR发现该基因是在烟草各个组织中都表达，且在烟草茎和叶芽中表达相对较高；通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，构建了用于沉默NtCCC基因的VIGS载体，转化后成功获得了抑制NtCCC在本氏烟草中表达的沉默植株，所获得的沉默植株拥有氯离子含量相对对照植株明显升高的特异表型；检测本氏烟草中植物氯离子的含量，发现基因沉默植株中氯离子含量显著升高，升高了至少50%，表明沉默该基因可以显著的提高植物的氯离子含量。综上可以看出，利用基因沉默技术或敲除NtCCC基因能够获得氯离子含量升高的基因沉默植株，这使得高氯离子含量烟草育种成为可能，从而为烟草适应不同种植环境及改良盐碱地土壤提供了一种新的技术途径。附图说明图1为不同组织器官中NtCCC的相对表达量；图2为沉默植株中NtCCC基因的相对表达量；图3为烘干后病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的氯离子含量。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。生物材料：烟草材料：本氏烟草（Nicotianabenthamiana），一种商品化烟草品种；干扰载体：TRV，购自中国质粒载体菌细胞基因保藏中心；基因测序及引物合成，由上海生工提供完成；实验试剂：LATaq酶、PstI限制性内切酶，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等购自Takara公司，In-Fusion一步法克隆试剂盒购自clontech公司；RNA提取试剂盒购自于GeneAnswer公司；反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒购自Roche公司；蛋白胨、酵母提取物等购自Oxoid公司；部分试剂配方及配制方法简要说明如下：（1）LB液体培养基（1L）：10g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone），10g氯化钠（NaCl），5g酵母抽提物（yeastextract），高温高压灭菌；（2）YEB液体培养基（1L）：5g牛肉浸膏（beefextract），5g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone），5g蔗糖（sucrose），1g酵母抽提物（yeastextract），2ml1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；（3）1M2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH2O溶解MES，过滤灭菌，-20℃储存备用；（4）200mM乙酰丁香酮（Acetosyringone）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解乙酰丁香酮，-20℃储存备用；（5）MMA（1L）：20g蔗糖（sucrose），5gMSsalts（DuchefaBiochemie），1.95gMES，1ml乙酰丁香酮（200mM，），pH=5.6；实验仪器：PCR仪Tgradient，Biometra公司产品，实时定量PCR仪LightCycler96，Roche公司产品。实施例1本实施例主要就烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC的获得过程，简要介绍如下。以栽培种烟草叶片为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNA，反转录为cDNA备用；通过同源比对的方法，参考拟南芥AtCCC基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：F：5’-CGCGAGCTCGGTACCATGACCTGCAATAAACAT-3’，R：5’-GCTCACCATGGATCCCTATGTAAACAAAGTGAC-3’；以上述所制备cDNA为模板，利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个烟草阳离子/氯离子共转运基因

【技术特征摘要】
1.一个烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC，包括1113bp个碱基，该基因与氯离子转运相关，其碱基序列如SEQIDNO.1所示；其中第5位-477位核苷酸为特异性核酸片段。2.权利要求1所述烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC所编码共转运蛋白，其特征在于，包括370个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求2所述烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC所编码共转运蛋白在烟草中的应用，其特征在于，用于转运氯离子。4.权利要求1所述烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC在烟草中的应用，其特征在于，将该基因沉默后，植物体内氯离子可以得到富集。5.用于沉默权利要求1所述烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC的瞬时沉默载体，其特征在于，通过如下构建方法获得：将所述烟草阳离子/氯离子共转运基因NtCCC的特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：张慧，金立锋，徐国云，周会娜，李锋，翟妞，刘萍萍，陈霞，陈千思，郑庆霞，申晓晔，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41