早实枳PtFCA1基因的分离及在植物成花调控中的应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域。具体涉及早实枳PtFCA1基因的分离及在植物成花调控中的应用。PtFCA1基因的核苷酸序如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。该基因在fca‑1型拟南芥中异位超表达后可明显互补fca‑1型拟南芥晚花的表型且恢复根系的发育，因此该基因不仅可缩短植物的童期，促使植物早花，而且还可促进根系的发育。本发明专利技术的基因为多年生木本果树的育种和缩短开花的进程及促进植物根系的发育提供了新的生物资源。

Isolation of PtFCA1 gene from precocious trifoliate orange and its application in Flowering Regulation

The present invention belongs to the field of plant gene engineering technology. The isolation of PtFCA1 gene from trifoliate orange and its application in flowering regulation of plants. The PtFCA1 gene nucleotide sequence such as SEQ ID NO:1 shows, the gene encoding the protein sequence is shown as SEQ ID NO:2. The FCA gene in Arabidopsis type 1 ectopic over expression can significantly complementary phenotype of FCA type 1 Arabidopsis late flowering and restoration of root development, so the gene plants can not only shorten the juvenile period, the plant early flowering, but also can promote the development of root system. The gene provided a new biological resource for the breeding of perennial woody fruit trees and the process of shortening flowering and promoting the development of plant roots.

【技术实现步骤摘要】
早实枳PtFCA1基因的分离及在植物成花调控中的应用
本专利技术属于植物基因工程
具体涉及早实枳PtFCA1基因的分离及在植物成花调控中的应用。早实枳PtFCA1基因的核苷酸序列见序列表SEQIDNO：1所示，序列长度为2260bp。遗传转化fca‐1型拟南芥后，可以明显互补fca‐1型拟南芥晚花的表型，并可以恢复根系的生长。因此PtFCA1基因可提早植物的成花时间，对于缩短多年生果树的童期及作物的遗传改良有重要意义。
技术介绍
柑橘是我国南方重要的果树，且在亚热带地区的国家均有栽培。柑橘一般需要经历较长时间的童期才能开花结实，部分柑橘的童期长达10年。柑橘分为柑橘属、金柑属和枳属。枳属花芽分化在春季开始，中间经历一段时间休眠，经低温诱导后，在次年春季开花。同一个属不同种在花芽分化及开花次数之间也存在差异。以普通枳和早实枳为例，普通枳一年开花一次，早实枳一年开花2‐3次。早实枳春梢和夏梢的部分花芽(非休眠型花芽)不需要经过休眠及低温诱导就可以迅速发育并在当年开花，而早实枳春梢、夏梢一部分花芽跟普通枳的花芽(休眠型花芽)相似，需要休眠后经过低温诱导次年春季开花。在对早实枳和普通枳花芽分化的研究中发现，自剪后具有成花能力的枝条会由营养生长转入生殖生长阶段，表明自剪对柑橘的花芽分化具有重要的作用，是具有成花能力的枝条发生成花转变的标志。除了响应外界环境调控开花时间外，植物随自身的发育状况也自主控制着开花的进程，当植物从营养分生组织、花序分生组织、花分生组织进行顺序转换时，其正常的开花程序即被启动(Srikanthetal.2011)，这种调控途径叫做自主途径(Simpsonetal.2002)。在拟南芥中，通过对缺失突变体的研究，分离鉴定得到一系列参与自主途径的基因，包括LD、FCA、FY、FPA、FLD、FVE、FLK和REF6S等，这些基因主要通过间接抑制FLC的表达来促进成花(Marquardtetal.2006)。遗传学研究表明，FCA和FLD属于同一条遗传途径，FCA上位作用于FLD调控成花(Liuetal.2009)。FCA蛋白含有2个RRM结构域和1个WW结构域，RRM结构域主要结合RNA分子，表明FCA可能参与转录后调控过程(Macknightetal.1997)。FCA蛋白通过WW结构域与一系列蛋白互作，其中FCA与FY的互作在植物中具有保守性，FCA与FY互作后影响许多转录本的选择性多聚腺苷磷酸化，如介导产生FLC反义转录本(Simpsonetal.2010)，同时FCA/FY复合体与位于FLC编码区第6个外显子和FLC反义转录本近端的多聚腺苷酸化位点结合，抑制FLC的表达(Liuetal.2008)。FY是酵母聚腺苷酸化因子Pfs2p的同源基因，是一个高度保守的RNA3’端的剪切因子，FCA也依赖FY激活前体mRNA内部的多聚腺苷酸化位点负调控自身的表达。FPA和FCA在调控RNA介导的FLC沉默过程中出现功能冗余的现象(etal.2007)。在水稻中，OsFCA的保守结构域与拟南芥FCA同源性很高；OsFCA时空表达模式与拟南芥中相似；同样能与OsFY互作；但不能完全互补fca‐1型拟南芥晚花表型，以上研究说明OsFCA在进化的过程中，部分功能发生了分化(Leeetal.2008)。在大麦中，FCA保守结构域与拟南芥和水稻的同源性也很高，但不能互补fca‐1型拟南芥晚花表型(Kumaretal.2011)。由此可见，FCA可能在单子叶和双子叶模式植物长距离的进化过程中发生功能分化。综上所述，FCA参与自主成花调控途径及温度途径。同时结合本研究前期通过转录组测序发现了成花自主调控基因FCA在普通枳和早实枳成花转变阶段存在差异表达(Aietal.2012)，并发现PtFCA在早实枳夏梢(具有成花能力)和普通枳夏梢(不具有成花能力)发育阶段中表达模式差异明显。该基因在拟南芥中的同源基因与温度调控开花有关，推测可能与早实枳夏梢在环境温度较高(不经过低温春化)的条件下成花相关；其次，由于在木本植物种中自主成花途径和环境温度途径研究较少，本专利技术针对PtFCA基因生物学功能及调控机理进行了较深入的研究。在借鉴一年生模式植物研究多年生植物成花调控的同时，也应进一步深入研究这些调控网络在多年生植物童期或者季节性成花中发挥的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的就是从早实枳(本领域中另称为枳壳)中分离出拟南芥FCA(GeneID为AT4G16280.1)的同源基因，并对其同源序列进行蛋白质序列的比对、聚类分析、时空表达模式、亚细胞定位、异位表达等进行分析。证实了该基因在早实枳成花转变过程中充当重要角色，为进一步缩短柑橘的童期及揭示柑橘及多年生植物的早花机制奠定了一定基础。申请人将分离克隆的基因命名为PtFCA1基因(GeneID为orange1.1g005357m)，早实枳中PtFCA1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，序列长度为2260bp。在拟南芥中，将其遗传转化fca‐1型拟南芥后，可以明显互补fca‐1型拟南芥晚花的表型，并可以恢复根系的生长。因此PtFCA1基因可提早植物的成花时间，对于缩短多年生果树的童期及作物的遗传改良有重要意义。具体地，本专利技术通过以下技术方案实现：申请人通过基因克隆技术从早实枳中分离得到FCA的同源基因PtFCA1(其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示)。聚类分析显示FCA基因在双子叶植物和单子叶植物的进化中出现了明显的分支，其中PtFCA1和拟南芥FCA亲缘关系较近。同源序列的比对显示除了FCA蛋白的一些共性外，PtFCA1还有其独特的特点。亚细胞定位显示PtFCA1蛋白主要定位于细胞核中，表明PtFCA1基因是作为转录因子起作用的。RT‐PCR显示PtFCA1基因在早实枳春梢和夏梢的表达模式一致，都是在自剪后表达升高，表明PtFCA1基因参与到早实枳的成花转变过程中；同时又检测PtFCA1基因在早实枳童期向成年期转变过程中，表达是逐渐升高的，表明PtFCA1基因可维持植物的生殖生长；同时PtFCA1基因在根中的表达高于在其它部位的表达，表明PtFCA1基因参与到根系的发育过程中。通过在fca‐1型拟南芥中超表达该基因发现，可以部分互补fca‐1型拟南芥的晚花且恢复根长，表明PtFCA1基因参与到植物的成花及根的发育过程中。申请人提供了一种PtFCA1基因超表达在调控植物成花或调控植物根系发育中的应用，包括下列步骤：(1)参考柑橘因组搜索FCA的同源基因，获得PtFCA1基因的序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；(2)通过荧光定量PCR检测PtFCA1基因在早实枳春梢和夏梢自剪前、自剪中和自剪后的表达；(3)通过荧光定量PCR检测PtFCA1基因在早实枳童期、转变期和成年期中的表达；(4)通过荧光定量PCR检测PtFCA1基因在早实枳不同部位的表达；(5)利用PtFCA1基因的生物信息学分析‐聚类分析和蛋白同源性进行比较分析；(6)融合GFP蛋白对洋葱表皮细胞进行瞬时表达转化；(7)构建PtFCA1超表达载体转化植物(优选例子是拟南芥)；所述的PtFCA1超表达载体含有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；(8)对转基因植物(优选例子是拟南芥)进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个从早实枳中分离克隆的FCA家族的同源基因PtFCA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一个从早实枳中分离克隆的FCA家族的同源基因PtFCA1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一个从早实枳中分离克隆的FCA家族的同源基因PtFCA1，其编码的蛋白质序列如SEQIDNO：2所示。3.权利要求1或2所述的基因超表达在调控植物成花中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括下列步骤：(1)参考柑橘基因组搜索FCA的同源基因，获得PtFCA1的基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；(2)通过荧光定量PCR检测PtFCA1在早实枳春梢和夏梢自剪前、自剪中和自剪后的表达；(3)通过荧光定量PCR检测PtFCA1在早实枳童期、转变期和成年期中的表达；(4)通过荧光定量PCR检测PtFCA1在早实枳不同部位的表达；(5)利用PtFCA1的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡春根，张金智，侯小进，艾小艳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42