本发明专利技术涉及Streptomyces hirsutus ATCC 19091蛋白的新用途，属于生物技术领域。具体来说，是指Streptomyces hirsutus ATCC 19091蛋白作为催化剂的用途。通过其催化L‑2‑哌啶甲酸的合成体系，具有底物投量高，反应时间短，产物ee值高的特点。
New uses of Streptomyces hirsutus ATCC 19091 protein
The invention relates to a new application of Streptomyces hirsutus ATCC 19091 protein, which belongs to the field of biotechnology. Specifically, refers to the Streptomyces hirsutus ATCC 19091 protein use as catalyst. Through the L 2 Nipecotic acid catalytic synthesis system, with high substrate dosage, short reaction time, high EE value of product features.
【技术实现步骤摘要】
StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的新用途
本专利技术涉及StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的新用途，属于生物
技术介绍
StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白是来源于Streptomyceshirsutus的一种蛋白，其氨基酸序列为序列表中序列2。用于其编码的基因序列为序列表中序列1。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的一种新用途，具体来说，是指其作为催化剂的用途。更进一步地，是用以催化L-赖氨酸盐酸盐或L-赖氨酸生物转化制备L-2-哌啶甲酸的反应。为了实现StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的催化作用，我们需要获得一种可以高效表达这一蛋白的菌体，从而以全细胞催化剂的形式将其加入到反应体系中。在本专利技术中，我们选定的用于高效表达StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的菌体为大肠杆菌。然而，在StreptomyceshirsutusATCC19091中用以编码StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的野生型基因序列GC含量过高，在宿主菌中培养时难以实现高效转录。故通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，并且调整DNA序列的GC含量到40％～60％，以实现在大肠杆菌中的高表达。首先，我们利用PrimerPremier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。2mMdNTPmix(2mMeachdNTP)5μl10×Pfubuffer5μlPfuDNApolymerase(10U/μl)0.5μlddH2O使得反应体系总体积至50μl将配制好的PCR反应体系置于博日XPcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，65℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQIDNO.3。按照图1的方式构建含有SEQIDNO.3的表达质粒。挑取含有SEQIDNO.3的表达质粒的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。将所收集得到的大肠杆菌作为全细胞催化剂加入至L-赖氨酸盐酸盐生物转化制备L-2-哌啶甲酸的反应中，从而获得了一种高效率的生物催化系统。这一系统具有底物投量高，反应时间短，产物ee值高的特点。附图说明图1为SEQIDNO.3的表达质粒图谱图2为含有SEQIDNO.3表达质粒的大肠杆菌的SDS-PAGE图谱。图3为生物转化反应的TLC图谱图4为L-2-哌啶甲酸的HPLC谱图图5为L-2-哌啶甲酸的MS谱图具体实施方式为了更好的解释本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行进一步的阐述。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。以下实施例中涉及到的TLC检测中：展开剂：三氯甲烷：甲醇：水＝6:5:1，混匀后放置10min左右。硅胶板规格：薄层层析硅胶板5*10。显色剂：茚三酮显色100ml乙醇加入0.1g茚三酮，500ul冰乙酸混匀。以下实例中涉及到的LC-MS检测条件为：PrevailC18色谱柱(250×4.6mm，i.d.5μm)；柱温：30℃；流动相：0.4％(v/v)三氟乙酸水溶液；流速：0.5ml/min；检测器：蒸发光散射检测器(ELSD)；检测器温度：120℃；载气：氮气(纯度99.9％)；载气流速：4L/min；进样体积：10μL。实施例1将StreptomyceshirsutusATCC19091置于ATCCMedium196培养基中培养，控制温度为26.0℃，180rpm培养2天，离心收集沉淀，用DNA提取纯化试剂盒QiAampKit(Qiagen，Germany)提取纯化StreptomyceshirsutusATCC19091基因组DNA。用Pfu高保真酶对StreptomyceshirsutusATCC19091基因组DNA进行PCR扩增，所用引物为Shi-F5'ATCTTGCAAGCTGAGCGCACG3'Shi-R5'TCATCGTCGCGCTCCGGC3'由于StreptomyceshirsutusATCC19091的DNA局部GC含量接近80％，故在扩增时添加终浓度0.5M的甜菜碱。之后将扩增的片段用Taq聚合酶72℃处理10分钟，在DNA3'端添加碱基A。之后将其连接到pMD19T-simple(Takara宝生物公司，北京)克隆载体中，挑取单克隆送至上海杰李生物进行测序。测序得到DNA序列为SEQIDNO.1，相应的氨基酸序列为SEQIDNO.2实施例2通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，并且调整DNA序列的GC含量到40％～60％，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用PrimerPremier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。2mMdNTPmix(2mMeachdNTP)5μl10×Pfubuffer5μlPfuDNApolymerase(10U/μl)0.5μlddH2O使得反应体系总体积至50μl将配制好的PCR反应体系置于博日XPcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，65℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DN本文档来自技高网...
【技术保护点】
Streptomyces hirsutus ATCC 19091蛋白作为催化剂的用途，所述的Streptomyces hirsutus ATCC 19091蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
【技术特征摘要】
1.StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白作为催化剂的用途，所述的StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁雪峰，
申请(专利权)人：南京诺云生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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