本发明专利技术公开了适合规模化高效纯化水溶性氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物的方法，属生物技术领域。针对目前氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物纯化工艺复杂，回收率低，难以实现规模化生产的弊端，本发明专利技术通过采用单端氨基化聚乙二醇封闭氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物的残留羧基，降低偶联产物的表面ζ电位，通过调整溶液pH值至5.0，进一步降低偶联产物在溶液中的净电荷含量、实现普通高速离心法规模化高效纯化氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物。本发明专利技术简化了氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物的实验操作流程，降低了对分离设备的要求，适合大批量纯化氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物，得率在90%以上，且偶联产物光特性、生物活性未见明显变化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纳米材料生物学修饰以及偶联物纯化的新方法，具体是涉及一种高效纯化水溶性羧基化氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物的新方法。
技术介绍
链霉亲和素是一种与亲和素有相似生物学特性的蛋白质，可以高度特异性地结合一种水溶性的维生素:D_生物素，其与生物素的亲和力非常强，它们之间的Kd值接近10-15M。完整的链霉亲和素是由四条相同肽链组成的四聚体，总分子量约为66.5kDa，并且每一个链霉亲和素分子可以紧密结合四个生物素分子，平均每条肽链(单体)可以结合一个生物素分子。完整的四聚体链霉亲和素还具有热稳定性好，对强酸、十二烷基磺酸钠、尿素、盐酸胍的耐受性强等特点，这些特点使得生物素-链霉亲和素系统具有高亲和力、灵敏度高、特异性强、稳定性好，信号放大作用等众多优势，此外生物素具有非常易于与种类繁多的生物活性分子(如蛋白，核酸和糖类等)发生偶联的优点，使得生物素-链霉亲和素广泛应用于免疫学、分子生物学和组织化学等领域，并已经取得较好的效果。自上世纪60年代人工制造出磁性纳米颗粒后，磁性纳米材料的合成和应用等方面得到了迅速发展。近年来磁性纳米粒子已在各个领域得到广泛应用，如:生物分离、药物转运、过热治疗、酶的固定、免疫测定、组织修复和磁共振成像等。但是，磁性纳米粒子具有较高的表面能，在溶液相中具有强烈的聚集倾向，使得磁性纳米粒子在应用方面受到很大限制，特别是在生物和医药等领域，要求磁性纳米粒子具有很好的稳定性、生物相容性和生物可降解性。通过表面共聚和表面改性，可降低纳米粒子的表面能，由此获得可溶性或可分散性好的纳米粒子。经过处理后形成的磁性复合粒子既具有磁性，又具有表面活性基团，能进一步与药物、抗体、蛋白质、酶、细胞及DNA等多种分子偶联，可利用外部磁场靶向器官、组织或肿瘤。磁性纳米粒子的种类 有很多，比较常见的有N1、Fe、Co及其合金，氧化铁，铁氧体，其中以氧化铁(Y -Fe2O3, Fe3O4)磁性材料的应用最为广泛。在众多磁性纳米生物材料中，Fe3O4纳米粒子(iron oxide nanoparticles, IOs )(粒径小于IOnm)由于具有优越的超顺磁特性、非免疫原性、低毒性及较好的生物相容性，已在许多生物医学方面展示了独特的优势。然而，磁性纳米粒子并不具有链霉亲和素分子高亲和性，因此往往需要在其表面偶联上链霉亲和素分子形成磁性纳米粒子链霉亲和素偶联物。这样，这种偶联物就同时拥有了磁性纳米粒子的磁性等特殊的理化性质和链霉亲和素分子的高亲和性。总之，作为一种新型的生物标记物，氧化铁纳米粒子由于其特殊的理化性质，结合有机染料或荧光染料后，在细胞标记、活体细胞成像、活体动物体内荧光显微成像以及荧光标记的免疫学快速诊断技术等领域具有更为显著的优势。其中羧基功能团表面的水溶性氧化铁纳米粒子应用最为广泛，采用多羧基以及疏水链的两性聚合物是油溶性氧化铁纳米粒子转化为羧基表面的水溶性氧化铁纳米粒子最常用方法。由于链霉亲和素结合生物素类似于化学偶联的亲和效果，因此氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联产物被认为制备各类生物荧光探针的共同载体得到了广泛的应用。羧基化氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联常用方法为EDC/NHSS介导的活泼酯方法。在氧化铁纳米粒子与链霉亲和素质偶联过程中，将氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物与溶液中游离链霉亲和素进行高效分离，是保证氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物使用效率的前提。目前，氧化铁纳米粒子链霉亲和素标记探针纯化方法主要包括以下几种。第一，超速离心方法。由于水溶性氧化铁纳米粒子纳米粒子粒径小，比表面积大，纳米材料与链霉亲和素偶联物表面含有大量的羧基，因此采用常规离心(低于30，OOO g离心力)，氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物回收效率普遍偏低(小于50%)，若要将氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物回收效率提高至90%以上，离心速度一般需大于50，000 g。第二种常见纯化方法为凝胶色谱法。该方法利用氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物与标记链霉亲和素的分子量差异(表现为光学以及水化粒径的差异)，利用排阻层析原理进行分离。第三种常用分离方法为超滤分离法。该法利用超滤管的超滤膜截流分子量差异将标记链霉亲和素与氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物进行分离的一种方法。同时还有基于琼脂糖凝胶以及琼脂糖-聚丙烯酰胺杂合凝胶电泳等的纯化分离方法。总之，利用以上纯化方法虽然可以获得较高质量的氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物，但仍存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低等缺陷，很难实现规模化生产。
技术实现思路
水溶性氧化铁纳米粒子是一种良好的纳米标记材料，该材料通过与抗体、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G以及配体或受体分子偶联，可广泛应用于磁共振成像(MRI)造影剂、细胞分离、细菌分离、药物靶向运输、靶向治疗以及免疫快速诊断等诸多领域。但是传统的氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物纯化方法存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低以及很难实现规模化生产等缺陷。本专利技术的目的是提供一种操作简便、分离效率高、大批量纯化氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物的新方法， 具体包括以下步骤: 一种高效纯化水溶性氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物的新方法，其特征在于包括以下步骤:(1)将水溶性羧基修饰的氧化铁纳米粒子活化，加入链霉亲和素溶液，调整溶液pH至7.5~8.5后，偶联反应；(2)偶联反应结束后，溶液中加入单端氨基化聚乙二醇(H0-PEG-NH3 )封闭偶联产物中氧化铁纳米粒子表面残留的羧基，将反应溶液pH值调整至弱酸性；(3)用SuperMagTM(磁场强度为100 T/m)分离器或高速离心，弃上清液，取沉淀。步骤(3)后，还有将沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L pH 7.0~7.5磷酸盐缓冲液溶解步骤。所用的水溶性氧化铁纳米粒子为核壳结构的氧化铁纳米粒子，壳层由双亲聚合物组成，外部为大量亲水羧基表面，内层为长链疏水基团通过与三辛基氧化磷的疏水作用将油溶性氧化铁纳米粒子包裹在壳层内部。步骤(1)所述活化为将水溶性羧基修饰的氧化铁纳米粒子溶解于pH 5.0~6.0，0.05 mol/L硼酸盐缓冲液中，分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37°C反应2小时，活化水溶性氧化铁纳米粒子羧基。所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺与氧化铁纳米粒子的摩尔比均为100~200:1，优选为150:1 ;所述IgG类链霉亲和素偶联物与氧化铁纳米粒子的摩尔比为1~10:1 ; 偶联反应结束后，在溶液中加入单端氨基化聚乙二醇(HO-PEG-NH3)至单端氨基化聚乙二醇终浓度为1%~2%，充分混匀15~30分钟。步骤(2)中将反应溶液pH值调整至弱酸性为将pH值调整至4.5-5.0，优选为5.0。步骤(3)所述的SuperMag?磁场强度为100 T/m或高速离心离心力为28，000~30,000go还包括将沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L pH 7.0~7.5磷酸盐缓冲液溶解备用的步骤。步骤(1)用0.1~1.0 M NaOH溶液调整溶液pH至7.5~8.5。原理见图1。所述水溶性羧基修饰的氧化铁纳米粒子制备方法为: 室温下，取0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纯化水溶性氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将水溶性羧基修饰的氧化铁纳米粒子活化，加入链霉亲和素溶液，调整溶液pH至7.5～8.5后，偶联反应；（2）偶联反应结束后，溶液中加入单端氨基化聚乙二醇（HO?PEG?NH3）封闭偶联产物中氧化铁纳米粒子表面残留的羧基，将反应溶液pH值调整至弱酸性；（3）用磁场强度为100?T/m?SuperMagTM分离器或高速离心，弃上清液，取沉淀。
【技术特征摘要】
1.一种纯化水溶性氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物的方法，其特征在于包括以下步骤:(1)将水溶性羧基修饰的氧化铁纳米粒子活化，加入链霉亲和素溶液，调整溶液pH至7.5~8.5后，偶联反应；(2)偶联反应结束后，溶液中加入单端氨基化聚乙二醇(HO-PEG-NH3)封闭偶联产物中氧化铁纳米粒子表面残留的羧基，将反应溶液pH值调整至弱酸性；(3)用磁场强度为100 T/m SuperMag?分离器或高速离心，弃上清液，取沉淀。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)后，还有将沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L pH 7.0~7.5磷酸盐缓冲液溶解步骤。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于水溶性氧化铁纳米粒子为核壳结构的氧化铁纳米粒子，壳层由双亲聚合物组成，外部为大量亲水羧基表面，内层为长链疏水基团通过与三辛基氧化磷的疏水作用将油溶性氧化铁纳米粒子包裹在壳层内部。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中活化为将水溶...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊勇华，许恒毅，罗薇，赖卫华，魏华，黄小林，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：
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