一种利用甘露聚糖高效生产2制造技术

本发明专利技术公开了一种利用甘露聚糖高效生产2

【技术实现步骤摘要】
一种利用甘露聚糖高效生产2
′‑
岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌工程菌株


[0001]本专利技术提供了一种利用甘露聚糖高效生产2
′‑
岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌工程菌株，属于合成生物学和微生物代谢工程


技术介绍

[0002]肠道微生物的组成会影响人类健康。母乳是婴儿最重要的食物，其含有的特殊成分，如寡糖、抗体和维生素，通过塑造婴儿肠道微生物组的组成而影响健康。母乳寡糖(HMO)是母乳中的主要可溶性固形物，其中2
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岩藻糖基乳糖(2
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FL)是最丰富的HMOs，占总量的30％。它由L
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岩藻糖、D
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半乳糖和D
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葡萄糖组成。2
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FL的生物活性近年来备受关注，研究者普遍认为它是保障婴儿健康发育的重要因素。深入的研究发现，婴儿虽然难以消化2
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FL，但是它在发育中起着至关重要的作用免疫系统，如调节肠道和抑制病原体感染。目前，2
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FL已被美国、欧洲等批准为用于婴儿配方奶粉的益生元。
[0003]近年来，研究者已开始广泛地使用微生物发酵法生产2
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FL，主要使用大肠杆菌和酵母等模式微生物。大肠杆菌自身含有2
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FL合成途径的多个基因，如甘露糖变位酶、甘露糖
‑1‑
磷酸
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鸟苷酸转移酶等，易于构建完整的合成途径，因此研究最为广泛。然而大肠杆菌并非食品安全微生物，其所生产的产物应用于食品会存在问题。由于枯草芽孢杆菌是一种食品安全型菌株，研究者已利用这一宿主进行2
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FL合成途径的构建和发酵生产。目前存在的主要问题是，异源基因在枯草芽孢杆菌中表达量较低，造成途径的合成效率不高；另一方面，枯草芽孢杆菌在现有的2
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FL发酵中主要以葡萄糖、甘油等精细碳源为培养基，而使用来源更为广泛和廉价的玉米粉质原料时效果较差。此外，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在规模化生产中都面临着比较严重的噬菌体侵染风险。
[0004]地衣芽孢杆菌是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。在工业发酵中地衣芽孢杆菌可发酵的原料种类更广，对噬菌体的抵抗性能更强。现有菌种的2
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FL合成途径均以葡萄糖、果糖或者甘油为起始底物。地衣芽孢杆菌可以分泌甘露聚糖酶，从而分解细胞外的甘露聚糖进行生长代谢。由于甘露糖是2
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FL合成途径的重要中间化合物，直接分解细胞外的甘露聚糖，并将甘露糖转运至细胞内参与2
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FL的合成，在生产效率和成本方面与现有合成路线相比具有明显的优势。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了提供一种能在地衣芽孢杆菌中高效表达目的基因的启动子及重组质粒的构建与应用。
[0006]本专利技术通过代谢工程改造，使得地衣芽孢杆菌可以利用魔芋粉这一廉价原料，分解并高效转运甘露糖至细胞内，并以GDP
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甘露糖为前体合成GDP
‑
岩藻糖，再通过异源表达岩藻糖基转移酶，得到了高产2
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FL的地衣芽孢杆菌工程菌株。地衣芽孢杆菌合成2
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FL的
人工途径以甘露聚糖类底物(魔芋粉、瓜尔豆胶等)及玉米粉作为碳源，利用自身的甘露聚糖酶和玉米粉酶水解获得甘露糖和葡萄糖。葡萄糖作为细胞的能量来源，甘露糖经过磷酸转移系统磷酸化后，利用异源表达的磷酸甘露糖变位酶得到六磷酸甘露糖。再分别经过异源表达的甘露糖
‑1‑
磷酸
‑
鸟苷酸转移酶、GDP
‑
甘露糖
‑
4,6
‑
脱水酶和GDP
‑
L
‑
岩藻糖合成酶得到GDP
‑
L
‑
岩藻糖，再利用岩藻糖基转移酶得到2
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FL(图1)。
[0007]本专利技术提供了一株高产2
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FL的地衣芽孢杆菌工程菌株，所述地衣芽孢杆菌工程菌株中过表达甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白(N1)、磷酸甘露糖变位酶(N2)、甘露糖
‑1‑
磷酸
‑
鸟苷酸转移酶(N3)、GDP
‑
甘露糖
‑
4,6
‑
脱水酶(N4)、GDP
‑
L
‑
岩藻糖合成酶(N5)以及岩藻糖基转移酶(N6)。
[0008]在一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌工程菌株过表达了含有甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白的表达框，含有编码磷酸甘露糖变位酶基因的表达框、含有编码甘露糖
‑1‑
磷酸
‑
鸟苷酸转移酶基因的表达框、含有编码GDP
‑
甘露糖
‑
4,6
‑
脱水酶基因的表达框、含有编码GDP
‑
L
‑
岩藻糖合成酶基因的表达框以及含有编码岩藻糖基转移酶基因的表达框。
[0009]在一种实施方式中，所述甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白来源于大肠杆菌Escherichia coli、磷酸甘露糖变位酶来源于大肠杆菌Escherichia coli、甘露糖
‑1‑
磷酸
‑
鸟苷酸转移酶来源于大肠杆菌Escherichia coli、GDP
‑
甘露糖
‑
4,6
‑
脱水酶来源于大肠杆菌Escherichia coli、GDP
‑
L
‑
岩藻糖合成酶来源于大肠杆菌Escherichia coli以及岩藻糖基转移酶来源于幽门螺杆菌Helicobacterpylori。
[0010]在一种实施方式中，利用启动子P
lan
对基因进行过表达，利用终止子ter终止基因的表达。
[0011]在一种实施方式中，所述甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述磷酸甘露糖变位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述甘露糖
‑1‑
磷酸
‑
鸟苷酸转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述GDP
‑
甘露糖
‑
4,6
‑
脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述GDP
‑
L
‑
岩藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0012]在一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌工程菌株的出发菌株为地衣芽孢杆菌ATCC9945A。
[0013]在一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高产2
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FL的地衣芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌工程菌株中过表达甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖
‑1‑
磷酸
‑
鸟苷酸转移酶、GDP
‑
甘露糖
‑
4,6
‑
脱水酶、GDP
‑
L
‑
岩藻糖合成酶以及岩藻糖基转移酶。2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白来源于大肠杆菌Escherichia coli、磷酸甘露糖变位酶来源于大肠杆菌Escherichia coli、甘露糖
‑1‑
磷酸
‑
鸟苷酸转移酶来源于大肠杆菌Escherichia coli、GDP
‑
甘露糖
‑
4,6
‑
脱水酶来源于大肠杆菌Escherichia coli、GDP
‑
L
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岩藻糖合成酶来源于大肠杆菌Escherichia coli以及岩藻糖基转移酶来源于幽门螺杆菌Helicobacterpylori。3.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，利用启动子P
lan
对基因进行过表达，利用终止子ter终止基因的表达。4.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌工程菌株的出发菌株为地衣芽孢杆菌ATCC 9945A，以质粒pHY和pHT43为表达载体。5.根据权利要求4所述的地衣芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，利用质...

【专利技术属性】
技术研发人员：李由然，丁雪峰，王勇，石贵阳，
申请(专利权)人：南京诺云生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：