一种抗原肽RL‑佐剂CpGODN7909偶联物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于树突状细胞疫苗肿瘤免疫治疗领域，尤其涉及一种抗原肽RL‑佐剂CpGODN7909偶联物及其制备方法和应用技术。所述的RL‑CpG偶联物是由抗原肽RL利用偶联桥通过共价键与佐剂CpGODN7909连接而成；本发明专利技术所述RL‑CpG偶联物的合成方法，即抗原肽RL与偶联剂PDPH反应，纯化后与佐剂CpGODN7909反应，进而得到所需偶联物。采用上述技术方案，RL‑CpG偶联物在细胞外循环系统中能稳定存在，在树突状细胞内高浓度的谷胱甘肽和酸性的内体低pH下，抗原肽RL和佐剂CpGODN7909在胞内释放，避免药物在循环中降解，同时使其作用于同一个细胞，提高偶联物利用率，增强靶向抗肿瘤活性。

A RL adjuvant antigen peptide CpGODN7909 conjugates and preparation method and application thereof

The invention belongs to the field of dendritic cell vaccine immunotherapy, in particular to a RL adjuvant antigen peptide CpGODN7909 conjugate and its preparation method and application technology. RL CpG conjugates which is composed of a peptide RL by coupling bridge connected by a covalent bond with adjuvant CpGODN7909; synthesis method of the invention of the RL CpG conjugates, namely the antigen peptide RL and PDPH coupling agent reaction, the purified reaction and adjuvant CpGODN7909, and then obtain the required coupling. By adopting the technical scheme, the RL CpG conjugates in the extracellular loops in the system can exist stably in dendritic cells in the high concentration of glutathione and acidic endosomes under low pH, the release of antigen peptide RL and adjuvant CpGODN7909 in intracellular, avoid drug degradation in the cycle, and make its role in the same cell and improve the utilization rate of conjugates, enhanced targeting antitumor activity.

【技术实现步骤摘要】
一种抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物及其制备方法和应用
本专利技术属于树突状细胞疫苗肿瘤免疫治疗领域，尤其涉及一种抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物及其制备方法和应用技术。
技术介绍
树突状细胞疫苗，是一种继手术、化疗、放疗等传统治疗方法后的肿瘤免疫治疗方法，其具有靶向性强、耐药性低等优点，主要通过提高机体对肿瘤细胞的免疫应答，诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，靶向识别杀伤肿瘤细胞，避免免疫逃逸。但是，由于研究的抗原肽对树突状细胞的功能无显著影响，通常抗原肽与佐剂联合用药，进一步提高构建的树突状细胞疫苗对机体免疫反应，更有效激活抗原特异性的CTL。抗原肽RL是一种源于HLA-A0201限制性的肿瘤相关抗原AGR2的九肽，其序列为Arg-Ile-Met-Phe-Val-Asp-Pro-Ser-Leu。肿瘤相关抗原AGR2在乳腺癌细胞MDA-MB-231中高表达，在MCF-7中低表达，故抗原肽RL树突状细胞疫苗激活的CTL能够特异性杀伤MDA-MB-231细胞，对MCF-7的杀伤效果无显著变化。佐剂CpGODN7909是一种人工合成的非甲基化的脱氧核糖核苷酸，其序列为5´-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3´，与细菌DNA相近的免疫作用，能与树突状细胞内受体TLR-9结合，促进DC成熟和抗原递呈。所述的抗原肽RL和佐剂CpGODN7909的化学结构分别为：。目前，查阅国内外相关文献，没有抗原肽RL和佐剂CpGODN7909通过偶联剂PDPH共价连接相关报道。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物（即RL-CpG偶联物），该偶联物能够提高树突状细胞将抗原递呈于CD8+T细胞的功能；所述的RL-CpG偶联物用于构建树突状细胞疫苗，可以有效提高其靶向抗肿瘤效果。所述的RL-CpG偶联物是由抗原肽RL利用偶联桥通过共价键与佐剂CpGODN7909连接而成，其结构式如下：。所述的共价键为可断裂的酰腙键和二硫键。所述的偶联桥的结构式如下：。为了实现上述目的，本专利技术还提供RL-CpG偶联物的制备方法，具体包括以下步骤。（1）用Fmoc固相多肽合成技术制备N端半胱氨酸修饰的抗原肽RL，以Wang树脂为载体，EDCi/HOBt为缩合试剂，无水DMF为反应溶剂，氨基酸与EDCi、HOBt的摩尔比例为1：4：4，脱Fmoc试剂为20%PIP/DMF，脱树脂试剂为50%TFA/DCM，制备得式（a）。（2）5´端醛基化和磷酸二酯键的非桥氧原子硫代化修饰的佐剂CpGODN7909由上海生工生物工程股份有限公司提供，其结构式（b）。（3）将步骤（1）中产物（a）与偶联剂PDPH在无水甲醇中反应，制备得式（c）。（4）将步骤（3）中产物（c）与步骤（2）中得（b）在无水甲醇中反应，制备得式（d），即为目的产物RL-CpG偶联物。步骤（3）中，产物（a）与PDPH的摩尔比例为1：5。步骤（4）中，产物（c）与产物（b）的反应摩尔比例为5：1。所述的RL-CpG偶联物用于制备树突状细胞疫苗，尤其对HLA-A0201+和AGR2高表达细胞的特异性杀伤效应。本专利技术的显著效果。本专利技术提供的抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物（即为RL-CpG偶联物）是由抗原肽RL利用偶联剂PDPH通过共价键与佐剂CpGODN7909连接而成；体外培养诱导未成熟树突状细胞，负载RL-CpG偶联物，由于细胞内谷胱甘肽的含量高于细胞外，且酸性的内体内的pH低，RL-CpG偶联物可以在树突状细胞内释放出游离的抗原肽RL和佐剂CpGODN7909；佐剂CpGODN7909与细胞内TLR9受体结合，促进树突状细胞的成熟和表面共刺激分子CD80的表达；成熟的树突状细胞递呈抗原肽RL于CD8+T淋巴细胞成功诱导抗原肽RL限制性的细胞毒性T淋巴细胞，识别并杀伤抗原肽RL高表达的肿瘤细胞；为了抗原肽RL能通过GSH敏感的二硫键与偶联剂PDPH共价连接，其N端采用半胱氨酸修饰；为了提高佐剂CpGODN7909在体内的稳定性，对其磷酸二酯键进行非桥氧原子硫代修饰；同时对佐剂CpGODN7909的5´端进行醛基化修饰，为了其能通过pH敏感的酰腙与偶联剂PDPH共价连接。目前未发现其显著的副作用，是一种可以应用于临床的免疫佐剂。因此，本专利技术提供RL-CpG偶联物构建树突状细胞疫苗中应用。本专利技术制备的树突状细胞疫苗，采用二种可断裂共价键连接而成，确保细胞内药物释放，能够有效提高药物的利用率，提高其靶向抗肿瘤免疫能力；本专利技术的RL-CpG偶联物能够促进树突状细胞的成熟和共刺激分子的表达，成功诱导抗原肽RL特异性的CTL，增强靶向杀伤效果；实验发现，检测树突状细胞表面分子表达试验显示，分别将无药、抗原肽RL、佐剂CpGODN7909和RL-CpG偶联物孵育未成熟树突状细胞24h后，与无药组比较，RL-CpG偶联物和佐剂CpGODN7909的imDC的表面分子CD83和CD80的表达增加约15%，而抗原肽RL组无明显改变；细胞毒性试验显示，RL-CpG偶联物诱导的CTL与其他组比较后，能提高对HLA-A020+和AGR2高表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231的靶向杀伤作用，而对HLA-A020—和AGR2低表达的乳腺癌细胞MCF-7无显著杀伤作用。本专利技术所述RL-CpG偶联物的合成方法，即抗原肽RL与偶联剂PDPH反应，纯化后与佐剂CpGODN7909反应，进而得到所需偶联物。采用上述技术方案，RL-CpG偶联物在细胞外循环系统中能稳定存在，在树突状细胞内高浓度的谷胱甘肽和酸性的内体低pH下，抗原肽RL和佐剂CpGODN7909在胞内释放，避免药物在循环中降解，同时使其作用于同一个细胞，提高偶联物利用率，增强靶向抗肿瘤活性。附图说明图1为抗原肽RL-cys的高效液相图。图2为抗原肽RL-cys的质谱图。图3为RL-CpG偶联物的合成路线图。图4为中间产物RL-PDPH的质谱图。图5为RL-CpG偶联物的质谱图。图6为RL-CpG偶联物的稳定性结果图。图7为RL-CpG偶联物对树突状细胞影响的流式检测和统计结果图。图8为RL-CpG偶联物诱导CTL对MDA-MB-231和MCF-7的杀伤结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1。用半胱氨酸修饰的抗原肽RL（即RL-cys）的制备。采用Fmoc/t-Bu固相合成法合成抗原肽RL-cys，以Wang树脂为载体，EDCi/HOBt为缩合试剂，无水DMF为反应溶剂，25℃下在多肽自动合成仪中进行反应；首先将C端氨基酸Fmoc-Leu-OH偶联在树脂上，并用醋酸酐/吡啶过夜封闭树脂，真空干燥后，取制备的WangResin-Leu-Fmoc，进行树脂替代度计算。取上述反应制备的100mgWangResin-Leu-Fmoc，每次加入氨基酸之前，需加入5mL20%PIP/DMF反应30min，用2mlDMF清洗，5min/次，共3次；加入77mgEDCi和54mgHOBt再按照从C端到N端的氨基酸序列加入相应的氨基酸；在抗原肽RL的合成加入氨基酸的顺序和量为：260mgFmoc-Ser(t-Bu)-OH、203mgFmoc-Pro-OH、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗原肽RL‑佐剂CpGODN7909偶联物，其特征在于，所述的RL‑CpG偶联物是由抗原肽利用偶联桥通过共价键与佐剂连接而成，其结构式如下：

【技术特征摘要】
2017.04.06 CN 20171021999011.一种抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物，其特征在于，所述的RL-CpG偶联物是由抗原肽利用偶联桥通过共价键与佐剂连接而成，其结构式如下：。2.如权利要求1所述的抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物，其特征在于，所述的共价键为pH敏感的酰腙建和GSH敏感的二硫建。3.如权利要求1所述的抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物，其特征在于，所述的偶联桥的结构式如下：。4.如权利要求1所述的抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）用Fmoc固相多肽合成技术制备N端半胱氨酸修饰的抗原肽RL，以Wang树脂为载体，EDCi/HOBt为缩合试剂，无水DMF为反...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏敏杰，李亚楠，孙明立，于兆进，刘雯思，线云开，韩强，赵兰，边竞，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21