结直肠癌干细胞疫苗制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了结直肠癌干细胞疫苗制备方法及应用，通过使用来源于结直肠癌患者术后瘤组织细胞、人结直肠癌细胞系Lovo或小鼠结直肠癌细胞系CT26经过反复冻融法制备得到CD133

Preparation method and application of colorectal cancer stem cell vaccine

The present invention discloses colorectal cancer stem cell vaccine preparation and application, through the use of sources in postoperative patients with colorectal cancer tumor cells, human colorectal cancer cell line Lovo and mouse colorectal cancer cell line CT26 after repeated freezing and thawing were prepared by CD133

【技术实现步骤摘要】
结直肠癌干细胞疫苗制备方法及应用
本专利技术属于生物制品
，具体涉及结直肠癌干细胞疫苗制备方法及应用。
技术介绍
结直肠癌(ColorectalCancer)是常见的消化系统恶性肿瘤之一，位于癌症相关死亡原因第二位。相比于亚太地区的发展中国家来说，结直肠癌更易在欧美等发达国家发病。据2017中国城市癌症报告:结直肠癌在男性发病率位于第五，女性发病率位于第三，约50％的结肠癌患者在术后首个三年经历一次癌症复发，五年存活率因癌症向远端器官转移下降明显。研究认为，在结直肠癌演变过程中，基因的突变和微环境的改变进一步增加了结直肠癌恶性表型的发生，而癌干细胞(CancerStemCells,CSCs)学说对结肠癌的认识及治疗逐渐成为结肠癌研究领域的热点。癌干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的肿瘤细胞，广泛存在于结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中。研究表明，结直肠癌细胞系中存在数量极少却能促进肿瘤生长、转移与复发的一群细胞，研究者称之为结直肠癌CSCs。CSCs具有以下生物学特性：一是CSCs具有自我更新能力，表现为在软琼脂培养基上可以形成克隆，而大多数肿瘤细胞不能形成克隆；二是CSCs与正常干细胞一样，具有分化的能力，能分裂为两个不同DNA及染色质、中心小体混合物、蛋白质含量相等的细胞，并且促进肿瘤形成与转移；三是CSCs具有侧群细胞(sidepopulationcells)能力，能够将进入细胞核的荧光染料Hoechst33342及抗肿瘤药物排出胞外，从而助于肿瘤的抗化疗药及复发。四是CSCs能够表达与正常细胞、肿瘤细胞和干细胞相关的分子标记，如结直肠癌CSCs可表达CD44、CD133、CD166等特异性分子标记，其中CD133+表型细胞被广泛认为是结直肠癌CSCs。在CSCs的各种“干性”中，上皮-间质转化(Epithelial-MesenchymeTransition,EMT)特性使结直肠癌CSCs较普通肿瘤细胞有更强的运动能力，更易突破周围组织进入循环系统，并在靶器官形成远端转移，这可能是结直肠癌复发转移、无法根治的主要原因。干细胞是一类具有自我复制、更新功能和多向分化潜能的原始未分化细胞，分为胚胎干细胞、生殖干细胞和成体干细胞。突变的干细胞和前体细胞可能是CSCs的来源，肿瘤中CSCs的“干性”对于维持肿瘤增殖、耐药、侵袭与复发起决定性作用。因此，怎样杀灭肿瘤中“种子”细胞即CSCs，避免肿瘤治疗过程中出现的“死灰复燃”棘手问题，达到“斩草除根”治愈肿瘤目的，是目前应解决的核心问题。研究表明，继手术、放疗、化疗之后，结直肠癌干细胞疫苗逐渐成为结直肠癌生物治疗的有效方法之一。结直肠癌干细胞疫苗是指将分离的结直肠癌CSCs，经过物理、化学以及生物因素(病毒感染、基因转移等)的处理，改变或消除其致癌性，保留其免疫原性，并与佐剂等联合应用制备的、可诱导机体产生特异性抗CSCs免疫反应的一种新型疫苗。迄今为止，关于结直肠癌干细胞疫苗的研究仍处于临床前早期实验阶段。虽然结直肠癌CSCs表达抗原的免疫原性相对于普通结直肠癌细胞要稍强，但由于其是正常细胞演变而来，其抗原的免疫原性仍较弱，不能诱导很强的特异性免疫反应。因此有学者通过基因修饰等方法降低CSCs的致癌性，提高其免疫原性，制备得到结直肠癌干细胞疫苗，在鼠类体内应用结直肠癌干细胞疫苗收到明显抑制肿瘤生长与复发的效果。但由于人体免疫系统与鼠类有所差异，因此结直肠癌干细胞疫苗对于人体的免疫效果，还需要进一步的临床验证。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术的目的是提供结直肠癌干细胞疫苗制备方法及应用，该结直肠癌干细胞疫苗能增强小鼠免疫功能，引发良好的抗肿瘤效应。技术方案：结直肠癌干细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：步骤1，获取结直肠癌细胞，进行传代培养；步骤2，采用免疫磁珠分选缓冲液悬浮结直肠癌细胞；步骤3，在步骤2的细胞悬液中加入FcR阻断剂和CD133+磁珠标记的直标单克隆抗体，4℃孵育；步骤4，采用免疫磁珠分选缓冲液洗涤步骤3所得结直肠癌细胞；步骤5，采用免疫磁珠分选缓冲液重悬步骤4结直肠癌细胞；步骤6，把分离柱放入磁场中，加入步骤5的细胞悬液，用缓冲液冲洗收集阴性细胞，即CD133-结直肠癌细胞；步骤7，将分离柱移出磁场，用缓冲液冲洗收集阳性细胞，即CD133+结直肠癌干细胞；步骤8，采用免疫磁珠分选缓冲液悬浮步骤7得到的CD133+结直肠癌细胞，经反复冻融制得结直肠癌干细胞疫苗。进一步地，步骤1中所述获取结直肠癌细胞中的结直肠癌细胞为结直肠癌术后瘤组织细胞、人结直肠癌细胞系Lovo细胞或小鼠结直肠癌细胞系CT26细胞。进一步地，步骤2中每1×108结直肠癌细胞，加入300μL免疫磁珠分选缓冲液悬浮结直肠癌细胞。进一步地，步骤3中每1×108结直肠癌细胞，加入100μLFcR阻断剂，加入CD133+磁珠标记的直标单克隆抗体。进一步地，步骤5中每1×108结直肠癌细胞，加入500μL免疫磁珠分选缓冲液重悬结直肠癌细胞。进一步地，步骤8中是将CD133+结直肠癌干细胞置于-80℃冰箱冷冻30min后取出，置室温22℃自然溶解；反复冻融3次灭活后制得结直肠癌干细胞疫苗。上述制备方法制备得到的结直肠癌干细胞疫苗。上述结直肠癌干细胞疫苗在制备治疗结直肠癌药物中的应用。有益效果：1.本专利技术中使用来源于结直肠癌患者术后瘤组织细胞或人结直肠癌细胞系Lovo和小鼠结直肠癌细胞系CT26经过反复冻融法(而不是药物灭活法)制备得到CD133+结肠癌干细胞疫苗，该CD133+结肠癌干细胞疫苗在动物实验中能够减低免疫鼠血清TGF-β水平，提高IFN-γ水平，增强脾NK细胞杀伤活性和CDC活性，使免疫鼠抵抗结直肠癌细胞攻击，诱导免疫细胞靶向杀伤CD133+结直肠癌干细胞进而抑制肿瘤的生长。本专利技术研究发现该结直肠癌干细胞疫苗能增强小鼠免疫功能，引发良好的抗肿瘤效应。2.与药物灭活法相比，本专利技术采用反复冻融法制备结直肠癌干细胞疫苗，可使癌干细胞释放的优势抗原以及“危险信号”像Hsp70、Hsp90、DNA、RNA和尿酸等，易被体内DC表面清道夫受体A和TLR-4所结合，更易使DC吞入并促使其成熟和加工提呈抗原肽，有效诱导CD4+T和CD8+CTL免疫反应；此外整个肿瘤细胞溶解制备的疫苗可用于所有病人，不同于肿瘤来源的肽或蛋白质疫苗，需要考虑HLA问题。附图说明图1为试验例1中Lovo细胞系各组疫苗效应，图1A为不同疫苗免疫组裸鼠接种野生型Lovo细胞攻击35天后麻醉处死检测各组肿瘤大体标本，最长径线≤20mm；图1B为各疫苗免疫组裸鼠无瘤生存时间曲线；图1C为各疫苗免疫组裸鼠肿瘤体积增长曲线。图2为试验例1中CT26细胞系各组疫苗效应，图2A为不同疫苗免疫组BalB/c鼠接种野生型CT26细胞攻击35天后麻醉处死检测各组肿瘤大体标本，最长径线≤20mm；图2B为各疫苗免疫组BalB/c鼠无瘤生存时间曲线；图2C为各疫苗免疫组BalB/c鼠肿瘤体积增长曲线。图3为试验例2中Lovo细胞系各瘤苗免疫组裸鼠麻醉处死前获取眼眶血，血清中IFN-γ、TGF-β含量检测情况，图3A为检测各组裸鼠血清中IFN-γ含量，图3B为各组裸鼠血清中TGF-β含量。图4为试验例本文档来自技高网...

【技术保护点】
结直肠癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，获取结直肠癌细胞，进行传代培养；步骤2，采用免疫磁珠分选缓冲液悬浮结直肠癌细胞；步骤3，在步骤2的细胞悬液中加入FcR阻断剂和CD133

【技术特征摘要】
1.结直肠癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，获取结直肠癌细胞，进行传代培养；步骤2，采用免疫磁珠分选缓冲液悬浮结直肠癌细胞；步骤3，在步骤2的细胞悬液中加入FcR阻断剂和CD133+磁珠标记的直标单克隆抗体，4℃孵育；步骤4，采用免疫磁珠分选缓冲液洗涤步骤3所得结直肠癌细胞；步骤5，采用免疫磁珠分选缓冲液重悬步骤4所得结直肠癌细胞；步骤6，把分离柱放入磁场中，加入步骤5的细胞悬液，用缓冲液冲洗收集阴性细胞，即CD133-结直肠癌细胞；步骤7，将分离柱移出磁场，用缓冲液冲洗收集阳性细胞，即CD133+结直肠癌干细胞；步骤8，采用免疫磁珠分选缓冲液悬浮步骤7得到的CD133+结直肠癌细胞，经反复冻融制得结直肠癌干细胞疫苗。2.根据权利要求1所述的结直肠癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1中所述获取结直肠癌细胞中的结直肠癌细胞为结直肠癌术后瘤组织细胞、人结直肠癌细胞系Lovo细胞或小鼠结直肠癌细胞系CT...

【专利技术属性】
技术研发人员：窦骏，郭玫，赵枫姝，王净，侍方方，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32