一种检测心梗心衰的免疫层析试纸及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测心梗心衰的免疫层析试纸及其制备方法；旨在提供一种检测结果判读准确，交叉反应少的检测心梗心衰的免疫层析试纸，所述检测试纸包括底板，所述的底板上衔接有样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫，所述的结合垫上喷有由300nm免疫荧光微球标记的CRP抗体与鸡IgY，以及由200nm免疫荧光微球标记的NT‑proBNP抗体；所述的反应膜平行设有C质控线，T1检测线和T2检测线，所述的C线上包被有羊抗鸡IgY，T1检测线上包被有抗原CRP蛋白，T2检测线包被有抗NT‑proBNP抗体。

Immunochromatographic test paper for detecting heart failure of myocardial infarction and its preparation method

The present invention discloses immune chromatography test paper and its preparation method for detecting myocardial infarction; to provide a detection result interpretation accuracy, immunochromatographic strip little cross reactivity to detection of myocardial infarction, the test sample pad, which comprises a bottom plate, a combination pad, a reaction film and the absorption pad interface on the soleplate and with the pad sprayed by 300nm immunofluorescence microspheres labeled CRP antibody and chicken IgY, and by NT proBNP 200nm antibody immunofluorescence labeled microspheres; the reaction film in parallel with C control line, T1 line detection and T2 detection line, the line is coated with Goat anti C chicken IgY, T1 detection line coated with antigen CRP protein, T2 detection line coated with anti NT proBNP antibody.

【技术实现步骤摘要】
一种检测心梗心衰的免疫层析试纸及其制备方法
本专利技术涉及一种联合检测试纸，具体的说，是一种检测心梗心衰的免疫层析试纸，本专利技术还是涉及该检测试纸的制备方法。
技术介绍
C反应蛋白是急性时相反应蛋白之一，研究发现急性感染患者的血清能和肺炎双球菌细胞壁上的C多糖发生沉淀反应，后证实参与反应的是一种蛋白质，故称之为C反应蛋白。基因位于1号染色体q23，序列上高度保守，C反应蛋白属于穿透素家族成员之一，由5个相同的亚单位以非共价键形式结合，形成对称的环状五球体，中间环绕一孔型结构，其凹面含有配体结合位点，每个亚单位有206个氨基酸残基，相对分子质量为23×103。正常状态下，分子以五聚体形式存在，在酸性或碱性环境中也可分解为单体，从而引起某些免疫反应，但由于C反应蛋白单体存在于细胞膜而非血清中，故很难检测。炎症、感染、组织损伤时，在细胞因子(如白细胞介素、肿瘤坏死因子)等的刺激下，主要由肝脏生成并可在其他组织局部如神经细胞、单核细胞、淋巴细胞及动脉粥样硬化斑块内合成。C反应蛋白具有多种生物学功能，参与多种自身生理及病理生理过程，与磷脂胆碱残基具有高度亲和力，并且可以和多种自身配体如浆细胞脂蛋白，损伤细胞的细胞膜，小核糖体蛋白颗粒，调理素细胞等或外来配体如多聚糖、磷脂以及细菌、真菌、寄生虫等微生物的组分相结合，与这些配体结合后，可以激活补体活化的经典途径，但经典途径的激活仅限于其初级阶段，即产生调理素几乎不能激活晚期补体蛋白。因此不激活膜攻击复合体的强烈促炎作用，限制补体激活晚期炎症反应的发展及强度。同时，还能通过因子的介导抑制补体激活替代途径。可以看出C反应蛋白一方面参与机体的防御功能，另一方面对补体激活后的炎症反应所带来的潜在破坏性具有限制作用。近年来，随着检测方法的改进，特别是采用一些新的敏感的方法检测血清高敏C-反应蛋白，发现其轻度升高与冠状事件、中风及周围血管病相关联，是一种独立的危险因素，是预测急性冠脉综合征(ACS)患者、稳定性和不稳定性心绞痛及支架置入患者未来事件的因素。hs-CRP作为炎症标志物及AS、血栓形成疾病的介导和标志物在心血管疾病诊治中的应用越来越受到临床广泛重视。N末端脑钠肽前体是proBNP经酶切后的裂解产物。心肌细胞受牵拉或血管透避压超负荷时，可促使proBNP大量合成和分泌释放。ProBNP在分泌过程中或进入血液时等摩尔分解为具有生物活性的含32个氨基酸的C端片断(BNP)和含76个氨基酸的N端片断(NT-proBNP)。相对BNP，NT-proBNP在人体的生物半衰期较长(约1～2h；BNP约为20分钟)，血中浓度也相对较高(约BNP的15～20倍)。因此，NT-proBNP被认为是较好的能反映心脏功能的生化标志物，诊断有症状的心衰患者，心衰和急性冠脉综合症患者的预后评估和对用于指导心衰的治疗。NT-proBNP的检测，无论是单独进行或与其他标志物联合使用，确定无症状的心脏结构和功能异常，包括左室收缩功能障碍(LVSD)与左心室肥厚(LVH)，使得在临床前期这些疾病就可得到预防性治疗，以延缓或防止进展至心力衰竭(HF)。此外，最近的数据表明，某些生物标志物，包括NT-proBNP，也可确定没有明显心脏异常但心血管疾病发病率和病死率增加的个体。但是，hs-CRP和NT-proBNP检测试剂单一检测结果并不明确，在临床上仅能起指导意义；hs-CRP和NT-proBNP检测试剂单独检测一方面浪费样本，另一方面多次加样可能导致结果没有相关性。而将两个不同的项目结合在一条检测卡上，一方面存在着两种项目之间的干扰，通常存在着交叉反应，另一方面两个项目的结果解读也有比较大的困难。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种检测结果判读准确，交叉反应少的检测心梗心衰的免疫层析试纸。本专利技术的另外一个目的是提供上述检测试剂的制备方法。为解决以上技术问题，本专利技术提供的技术方案是这样的：一种检测心梗心衰的免疫层析试纸，包括底板，所述的底板上衔接有样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫，所述的结合垫上喷有由300nm免疫荧光微球标记的CRP抗体与鸡IgY，以及由200nm免疫荧光微球标记的NT-proBNP抗体；所述的反应膜平行设有C质控线，T1检测线和T2检测线，所述的C线上包被有羊抗鸡IgY，T1检测线上包被有抗原CRP蛋白，T2检测线包被有抗NT-proBNP抗体。进一步的，上述的一种检测心梗心衰的免疫层析试纸，所述的T1检测线位于T2检测线与C质控线之间，所述的T1检测线与T2检测线之间的距离为0.5cm，所述的T1检测线与C质控线为0.8cm。本专利技术提供的后一个技术方案是这样的：一种检测心梗心衰的免疫层析试纸的制备方法，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫；其中，所述的结合垫依次通过下述方法制得的：将抗NT-proBNP抗体免疫荧光微球溶液与抗CRP抗体免疫荧光微球溶液按1:1的体积比混合均匀，在混合液中加入10wt％鸡IgY免疫荧光微球溶液混合均匀，用喷金划膜仪喷至玻璃纤维素膜上，喷量为3～5μL/cm，放入37℃烘箱，干燥6-12小时。进一步的，上述的检测心梗心衰的免疫层析试纸的制备方法，所述的抗NT-proBNP抗体免疫荧光微球溶液的制备方法依次包括下述步骤：1)在1mL0.1MpH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(MES)加入15μL200nm免疫荧光微球；加入50μL10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和20μL50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，室温反应30min，再在16500rpm离心20min，去上清除去未反应的EDC和NHS，加入1mL0.1MpH6.0的MES，超声混匀；2)将抗NT-proBNP抗体按40μg/1mL的量，加入到步骤1)溶液中，混匀室温条件下旋转反应30min；3)反应完成后将免疫荧光微球溶液以4℃，16500rpm，10min离心，弃去上清，使用0.1MpH6.0MES缓冲液+0.02％TergitolNP9洗涤1-3次，加入1mL0.1MpH6.0的MES缓冲液重悬；4)将牛血清蛋白与卵清白蛋白(OVA)以1:8的比例混合后按10μg/1mL的量，加入到步骤3)溶液中，封闭未偶联抗体的活化羧基位点，反应20～40min；5)反应完成后将免疫荧光微球溶液以4℃，15000rpm，15min离心，弃去上清，使用0.1MpH6.0MES缓冲液+0.02％TergitolNP9洗涤1-3次，加入荧光复溶液后超声混匀。一种检测心梗心衰的免疫层析试纸的制备方法，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫；其中，所述的结合垫依次通过下述方法制得的：将抗NT-proBNP抗体免疫荧光微球溶液与抗CRP抗体免疫荧光微球溶液按1:1的体积比混合均匀，在混合液中加入10wt％鸡IgY免疫荧光微球溶液混合均匀，用喷金划膜仪喷至玻璃纤维素膜上，喷量为3～5μL/cm，放入37℃烘箱，干燥6-12小时。进一步的，上述的检测心梗心衰的免疫层析试纸的制备方法，所述的抗NT-proBNP抗体免疫荧光微球溶液的制备方法依次包括下述步骤：1)在1mL0.1MpH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测心梗心衰的免疫层析试纸，包括底板(1)，所述的底板(1)上衔接有样品垫(2)、结合垫(3)、反应膜(4)和吸收垫(5)，其特征在于，所述的结合垫(3)上喷有由300nm免疫荧光微球标记的CRP抗体与鸡IgY，以及由200nm免疫荧光微球标记的NT‑proBNP抗体；所述的反应膜(4)平行设有C质控线，T1检测线和T2检测线，所述的C线上包被有羊抗鸡IgY，T1检测线上包被有抗原CRP蛋白，T2检测线包被有抗NT‑proBNP抗体。

【技术特征摘要】
1.一种检测心梗心衰的免疫层析试纸，包括底板(1)，所述的底板(1)上衔接有样品垫(2)、结合垫(3)、反应膜(4)和吸收垫(5)，其特征在于，所述的结合垫(3)上喷有由300nm免疫荧光微球标记的CRP抗体与鸡IgY，以及由200nm免疫荧光微球标记的NT-proBNP抗体；所述的反应膜(4)平行设有C质控线，T1检测线和T2检测线，所述的C线上包被有羊抗鸡IgY，T1检测线上包被有抗原CRP蛋白，T2检测线包被有抗NT-proBNP抗体。2.根据权利要求1所述的一种检测心梗心衰的免疫层析试纸，其特征在于，所述的T1检测线位于T2检测线与C质控线之间，所述的T1检测线与T2检测线之间的距离为0.5cm，所述的T1检测线与C质控线为0.8cm。3.制备权利要求1所述的检测心梗心衰的免疫层析试纸的方法，其特征在于，在底板(1)上依次衔接有样品垫(2)、结合垫(3)、反应膜(4)和吸收垫(5)；其中，所述的结合垫依次通过下述方法制得的：将抗NT-proBNP抗体免疫荧光微球溶液与抗CRP抗体免疫荧光微球溶液按1:1的体积比混合均匀，在混合液中加入10wt％鸡IgY免疫荧光微球溶液混合均匀，用喷金划膜仪喷至玻璃纤维素膜上，喷量为3～5μL/cm，放入37℃烘箱，干燥6-12小时。4.根据权利要求1所述的检测心梗心衰的免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，所述的抗NT-proBNP抗体免疫荧光微球溶液的制备方法依次包括下述步骤：1)在1mL0.1MpH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液加入15μL200nm免疫荧光微球；加入50μL10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和20μL50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温反应30min，再在16500rpm离心20min，去上清除去未反应的EDC和NHS，加入1mL0.1MpH6.0的MES缓冲液，超声混匀；2)将抗NT-proBNP抗体按40μg/1mL的量，加入到步骤1)溶液中，混匀室温条件下旋转反应30min；3)反应完成后将免疫荧光微球溶液以4℃，16500rpm，10min离心，弃去上清，使用0.1MpH6.0MES缓冲液+0.02％TergitolNP9洗涤1-3次，加入1mL0.1MpH6.0的MES缓冲液重悬；4)将牛血清蛋白与卵清白蛋白(OVA)以1:8的比例混合后按10μg/1mL的量，加入到步骤3)溶液中，封闭未偶联抗体的活化羧基位点，反应20～40min；5)反应完成后将免疫荧光微球溶液以4℃，15000rpm，15min离心，弃去上清，加入荧光复溶液后超声混匀。5.根据权利要求1所述的检测心梗心衰的免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，所述的抗CRP抗体免疫荧光微球溶液依次通过下述步骤制得的：1)在1mL0.1MpH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液加入15μL300nm免疫荧光微球；加入50μL10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和20μL50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温反应30min；16500rpm离心20min，去上清除去未反应的EDC和NHS，加入1mL0.1MpH6.0的MES，超声混匀；2)将抗CRP抗体按40μg/1mL的量，加入到步骤1)溶液中，混匀室温条件下旋转反应30min；3)反应完成后将免疫荧光微球溶液以4℃，...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤永平，岳彦弢，李之华，张晓丽，潘秀华，叶向荣，
申请(专利权)人：广州市微米生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44