一种自身抗体流式检测试剂、制备方法及其检测方法技术

一种自身抗体流式检测试剂，包括带有荧光蛋白的过表达目的基因的细胞、荧光素标记的抗体，细胞经固定剂固化后为死细胞。本发明专利技术将目的抗原通过重组质粒于真核细胞中表达，进行细胞固定后制成自身抗体检测试剂，利用在真核细胞过表达的抗原对人体体液中自身抗体进行检测，用流式细胞仪进行结果的分析和判读，提高了抗体检测的灵敏度和特异性，同时具有操作简便、高通量等优点。高通量等优点。高通量等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种自身抗体流式检测试剂、制备方法及其检测方法


[0001]一种自身抗体流式检测试剂，包括带有荧光蛋白的过表达目的基因的细胞、荧光素标记的抗体，细胞经固定剂固化后为死细胞。本专利技术将目的抗原通过重组质粒于真核细胞中表达，进行细胞固定后制成自身抗体检测试剂，利用在真核细胞过表达的抗原对人体体液中自身抗体进行检测，用流式细胞仪进行结果的分析和判读，提高了抗体检测的灵敏度和特异性，同时具有操作简便、高通量等优点。

技术介绍

[0002]自身免疫性疾病与许多其他复杂疾病一样，是遗传和环境因素共同作用导致的固有免疫和适应性免疫的功能紊乱，产生自身抗体，攻击自身组织导致疾病发生。大多数自身免疫性疾病的发病机制是未知的，此类疾病会导致体征和症状的变化，其严重程度随时间变化，给患者造成了巨大的痛苦，自身免疫性疾病的诊疗正面临着巨大的挑战。
[0003]自身免疫性疾病的诊断多依赖于人体体液中自身抗体的检测，针对自身抗原的自身抗体大量产生，二者结合形成致病性免疫复合物沉积在局部导致炎症反应。自身抗体作为多种自身免疫系统疾病的重要标志物，在临床诊断和治疗中有着至关重要的作用。
[0004]目前用于检测自身抗体的商品化检测试剂主要有基于细胞的间接免疫荧光法（CBA
‑
IIFA）和酶联免疫吸附法（ELSIA）。CBA
‑
IIFA检测试剂制备工序繁琐，所需耗材多，且该方法为定性/半定量检测方法，不能提供定量结果。通过荧光显微镜进行结果判定，效率低，不适合高通量检测。ELSIA检测试剂制备周期较长，需经过抗原的表达、细胞裂解、抗原提取和纯化等多个步骤，每个步骤的差异化操作均可能影响抗原的产率与质量，进而影响试剂检测结果的稳定性和重复性。人体体液中自身抗体均以天然构象与人体自身表达的抗原发生反应，而抗原经过提取、纯化、包被等过程，难以避免会造成抗原构象的改变，进而影响自身抗体与抗原的结合，使抗原抗体的结合量下降，甚至出现假阳性或假阴性的情况。

技术实现思路

[0005]针对现行方法的不足，本专利技术公开一种自身抗体流式检测试剂、制备方法及其检测方法，将目的抗原通过重组质粒于真核细胞中表达，进行细胞固定后制成自身抗体检测试剂，利用在真核细胞过表达的抗原对人体体液中自身抗体进行检测，用流式细胞仪进行结果的分析和判读，提高了抗体检测的灵敏度和特异性，同时具有操作简便、高通量等优点。为达到上述专利技术的目的，本专利技术采取以下技术方案：一种自身抗体流式检测试剂，其特征在于，检测试剂包括带有荧光蛋白的过表达目的基因的细胞、荧光素标记的抗体，所述的细胞经固定剂固化后为死细胞。
[0006]进一步地，所述的荧光蛋白根据使用的流式细胞仪的配置进行选择，包括GFP、RFP、YFP、mCherry、mKate2、DsRed、EGFP、EYFP、TurboGFP、Venus、Citrin、CFP、mOrange、mPlum或mRuby。
[0007]进一步地，所述的固定剂选自醛类、甲醇、乙醇、丙酮、四氧化锇、苦味酸、氯仿、铬
酸、升汞、重铬酸中的一种或或多种制备成的溶液。
[0008]进一步地，所述的荧光素可根据使用的流式细胞仪的配置进行选择，包括APC、APC
‑
Cy7、FITC、RFP、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Cy5、PE
‑
Cy5、Cy5.5、PE
‑
Cy5.5或PE
‑
Cy7。
[0009]进一步地，所述的自身抗体，包括靶抗原为PLA2R1、THSD7A、NELL
‑
1、AQP4、MOG、GFAP、MBP、NMDAR、AMPAR、GABABR、LGI1、CASPR2、IgLON5、GAD65、mGluR1、mGluR5、Neurexin3α、GABAARα1、GABAARβ3、gAchR、AchR、Titin、MusK、LRP4、SOX1、Hu、Yo、Ri、Amphiphysin、CV2、Ma1、Ma2、Tr、NF155、NF186、CNTN1、CNTN2、CASPR1、Jo
‑
1或MDA5的自身抗体。
[0010]进一步地，所述的检测试剂还包括洗涤液，所述的洗涤液为含有EDTA和BSA的PBS混合溶液，其中EDTA的含量为0.05%~2.5%，BSA的含量为0.05%~10%。
[0011]进一步地，所述的带有荧光蛋白的过表达目的基因的细胞，制成悬液状；为方便储存、运输，也可将悬液状的细胞冻干粉，制成冻干粉能最大程度地延长效期，因冻干态的细胞含水量极低，检测试剂体积大大减小、储运方便。
[0012]本专利技术还公开了一种自身抗体流式检测试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1：获取目的抗原的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入带有荧光蛋白的真核细胞表达载体中，得到重组质粒载体；步骤2：将重组质粒载体转染入真核细胞中，得到过表达目的基因的细胞，使用抗生素筛选得到稳转细胞株；步骤3：使用固定剂将细胞固定，用封闭剂封闭细胞；步骤4：将步骤3的封闭细胞与荧光素标记的抗体为主要成分组成自身抗体流式检测试剂。
[0013]进一步地，所述的步骤1具体包括一下步骤：步骤1.1：通过人工合成或其他方式获得目的抗原的CDS序列作为目的基因，并在目的基因序列两端添加两个酶切位点，酶切位点为BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI或XhoI。
[0014]步骤1.2：将带有酶切位点的目的基因插入带有荧光蛋白的真核细胞表达载体中得到重组质粒。
[0015]进一步地，所述的制备步骤还包括冻干粉制备步骤，将所述的步骤3获得的封闭细胞中添加冻干赋形剂，分装到西林瓶中，半压塞置冷冻干燥机内冷冻干燥，压塞，即得细胞冻干粉。
[0016]进一步地，所述的冻干赋形剂包括甘露醇、海藻糖、右旋糖苷、壳聚糖、甘氨酸、氨基乙酸或精氨酸。
[0017]进一步地，所述的步骤2中可使用阳离子聚合物转染试剂或非脂质体转染试剂将重组质粒转染进入真核细胞中，使用抗生素G418、嘌呤霉素或潮霉素筛选得到稳定表达细胞株。
[0018]进一步地，所述的G418浓度为100
µ
g/ml
‑
1000
µ
g/ml，嘌呤霉素的浓度为1
µ
g/ml
‑
10
µ
g/ml，潮霉素的浓度为50
µ
g/ml
‑
500
µ
g/ml。
[0019]进一步地，所述的步骤3中使用的封闭剂包括BSA、山羊血清或酪蛋白。
[0020]进一步地，所述的质粒载体为适用于真核细胞表达的载体质粒，包括pcDNA3.1
（+/
‑
）、pLV、pCMV、pEGFP
‑
N1、pEGFP
‑
C1或pVAX1。
[0021]进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种自身抗体流式检测试剂，其特征在于，检测试剂包括带有荧光蛋白的过表达目的基因的细胞、荧光素标记的抗体，所述的细胞经固定剂固化后为死细胞。2.根据权利要求1所述的自身抗体流式检测试剂，其特征在于，所述的自身抗体包括靶抗原为PLA2R1、THSD7A、NELL
‑
1、AQP4、MOG、GFAP、MBP、NMDAR、AMPAR、GABABR、LGI1、CASPR2、IgLON5、GAD65、mGluR1、mGluR5、Neurexin3α、GABAARα1、GABAARβ3、gAchR、AchR、Titin、MusK、LRP4、SOX1、Hu、Yo、Ri、Amphiphysin、CV2、Ma1、Ma2、Tr、NF155、NF186、CNTN1、CNTN2、CASPR1、Jo
‑
1或MDA5的自身抗体。3.根据权利要求1所述的自身抗体流式检测试剂，其特征在于，所述的荧光蛋白包括GFP、RFP、YFP、mCherry、mKate2、DsRed、EGFP、EYFP、TurboGFP、Venus、Citrin、CFP、mOrange、mPlum或mRuby；所述的荧光素包括APC、APC
‑
Cy7、FITC、RFP、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Cy5、PE
‑
Cy5、Cy5.5、PE
‑
Cy5.5或PE
‑
Cy7；所述的固定剂选自醛类、甲醇、乙醇、丙酮、四氧化锇、苦味酸、氯仿、铬酸、升汞、重铬酸中的一种或多种制备成的溶液。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的自身抗体流式检测试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1：通过人工合成或其他方式获得目的抗原的CDS序列作为目的基因，并在目的基因序列两端添加两个酶切位点，酶切位点为BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI或XhoI，将带有酶切位点的目的基因插入带有荧光蛋白的真核细胞表达载体中得到重组质粒；步骤2：将重组质粒载体转染入真核细胞中，得到过表达目的基因的细胞，使用抗生素筛选得到稳转细胞株；步骤3：使用固定剂将细胞固定，用封闭剂封闭细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘书虎，谢作善，廖泓之，汪艳涛，
申请(专利权)人：广州市微米生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：