一种肺炎支原体检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了肺炎支原体的基于LAMP技术的检测试剂盒。LAMP引物根据肺炎支原体的特异保守序列设计，利用LAMP技术获得的扩增物，将扩增物进行荧光鉴定检测，从而判定样本中是否含有肺炎支原体。本发明专利技术为肺炎支原体测提供了一个新的技术平台，适宜在基层单位、现场监测和床旁检测中推广应用。和床旁检测中推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种肺炎支原体检测试剂盒


[0001]本专利技术属于以等温扩增及荧光侧向层析法相结合的分子生物学检测方法在肺炎支原体检测方面的应用。

技术介绍

[0002]肺炎支原体肺炎（MPP），通常简称为支原体肺炎，是由肺炎支原体（MP）引起的呼吸道和肺部间质性病变为主的急性炎症，常同时有咽炎、支气管炎、肺炎。该病有一定的自愈性，但也会出现脑膜炎、心肌炎、心包炎、肾炎、免疫性溶血性贫血等肺外并发症等可能危及生命。目前肺炎支原体肺炎并没有统一的诊断标准，一般要求诊断需结合临床症状、体征、胸部影像学及血清学检查结果。
[0003]环介导等温扩增技术(Loop
‑
mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新型等温核酸扩增技术，具有快速、简便、经济、灵敏等优点，目前已被广泛应用于核酸快速检测领域。LAMP的原理是针对靶基因上6个区域设计2对引物[FIP(F1c+F2)、BIP(B2+B1c)、F3、B3]，在链置换型DNA聚合酶的作用下，于等温条件在短时间内（15~90min）进行核酸扩增。
[0004]与传统PCR相比，LAMP具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果判定简单、成本低廉等特点。LAMP检测灵敏度至少比普通PCR 高出2个数量级。通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，阳性产物是片段大小不一的梯状条带，LAMP反应结果可视化呈现，是一种高效、简便、快捷、高通量的检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于：提供一种用于肺炎支原体的检测试剂盒；另一目的在于提供一种用于该肺炎支原体试剂盒的检测方法。
[0006]一种肺炎支原体检测试剂盒，该试剂盒包括：LAMP反应液、阳性对照液、荧光检测卡、样本稀释液；所述的LAMP反应液包括10
×
Buffer 、25 mmol/LMgSO4、25mmol/LdNTPs、8U/μLBst DNA聚合酶、5μmol/L的引物F3和B3、20μmol/L的引物FIP、BIP ；所述的引物F3为5
’‑
acaagccttagccgttat
‑3’
，所述的引物B3为5
’‑
gggctaagcttccatttgg
‑3’
，所述的引物FIP为5
’‑
tgccttaaactggttttggtctaatgttgatgccaactataaggaac
‑3’
，所述的引物BIP 为5
’‑
caccccaatgaggacgatcttctaccacttgttcagcc
‑3’
；所述的阳性对照液为含有肺炎支原体基因组特异性保守序列的质粒稀释液。
[0007]如上述所述的肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于所述的荧光检测卡包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫。
[0008]如上述所述的肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于所述的样本稀释液为磷酸盐缓冲液。
[0009]如上述所述的肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于所述的结合垫包被有经链霉亲和素修饰的微球。
[0010]如上述所述的肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于所述的硝酸纤维素膜上有两条线，一条是C线，包被有生物素
‑
BSA以捕获多余的链霉亲和素修饰显色微球；另一条是T线，包被有互补寡核苷酸以通过与引物５
’
末端的寡核苷酸杂交来特异性识别扩增子。
[0011]一种肺炎支原体的检测方法，主要包括以下步骤：1）使用磁珠法对待测样本进行核酸提取；2）以待测物的基因组DNA为模板，在权利要求1所述引物的引导下进行LAMP扩增；3）将扩增物用样本稀释液稀释，滴加1
‑
2滴在荧光检测卡的样品垫上，15min内观察硝酸纤维素膜上的C线和T线是否产生荧光。
[0012]如上述所述的肺炎支原体的检测方法，其特征在于：LAMP扩增的条件包括：反应温度60
‑
65℃、扩增时间60
‑
70min、内外引物浓度比0.2:0.8
‑
0.2:1.6、Mg
2+
浓度为4.0
‑
5.0mmol/L、dNTPs浓度为0.6 mmoL/L、Bst DNA聚合酶为4.8~9.6U。
[0013]如上述所述的肺炎支原体的检测方法，其特征在于：反应温度优选为60℃，扩增时间优选为60min，内外引物浓度比优选为0.2:0.8，Mg
2+
浓度优选为4.0mmol/L，Bst DNA聚合酶优选为8.0U。
[0014]如上述所述的肺炎支原体的检测方法，其特征在于：荧光检测卡上的C线和T线是否产生荧光，进行样本判定，当C线和T线均产生荧光，才能确定待测样品中含有肺炎支原体（阳性）。
[0015]根据肺炎支原体基因组特异性保守序列，应用在线引物设计软件Primer ExplorerV5，上传靶序列后，即可初步得到多组引物序列。
[0016]根据LAMP引物设计的关键因素，主要包括引物末端的稳定性、GC含量、引物间的距离和二级结构对其进行筛选，最终得到的LAMP引物。具体来说，为了在反应中能使F1c和B1c更加容易弯转，可以形成双茎环结构，引物F1c和B1c要高于其他几条引物的Tm值5℃左右。Tm值尽可能接近要求（60℃和65℃）。为提高核苷酸越与模板退火结合效率，每条引物最末端的六个碱基自由能
⊿
G值≤
‑
4Kcal/mol，F3/B3，F2/B2的3
’
末端
⊿
G值≤
‑
4Kcal/mol，F1c和B1c的5
’
端的
⊿
G值≤
‑
4Kcal/mol。对于引物的GC含量设定范围在40%~60%之间。对于引物之间的距离，从F2的5
’
端到B2的5
’
端应在120~180bp之间，从F2的5
’
端到F1c的3
’
端也就是茎环段在40~60bp之间，从F2的5
’
端到F3的3
’
端在0~20bp之间。最后要特别注意引物之间不能形成二级结构。通过以上设计原则筛选即得到最终引物如下。F35
’‑
acaagccttagccgttat
‑3’
B35
’‑
gggctaagcttccatttgg
‑3’
FIP5
’‑
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‑3’
BIP5
’‑
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[0017]本专利技术所提供的肺炎支原体的检测试剂盒，包含有上述LAMP检测的专用引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肺炎支原体检测试剂盒，该试剂盒包括：LAMP反应液、阳性对照液、荧光检测卡、样本稀释液；所述的LAMP反应液包括10
×
Buffer 、25 mmol/LMgSO4、25mmol/LdNTPs、8U/μLBst DNA聚合酶、5μmol/L的引物F3和B3、20μmol/L的引物FIP、BIP ；所述的引物F3为5
’‑
acaagccttagccgttat
‑3’
，所述的引物B3为5
’‑
gggctaagcttccatttgg
‑3’
，所述的引物FIP为5
’‑
tgccttaaactggttttggtctaatgttgatgccaactataaggaac
‑3’
，所述的引物BIP 为5
’‑
caccccaatgaggacgatcttctaccacttgttcagcc
‑3’
；所述的阳性对照液为含有肺炎支原体基因组特异性保守序列的质粒稀释液。2.根据权利要求1所述的肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于所述的荧光检测卡包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫。3.根据权利要求2所述的肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于所述的样本稀释液为磷酸盐缓冲液。4.根据权利要求2所述的肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于所述的结合垫包被有经链霉亲和素修饰的微球。5.根据权利要求2所述的肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于所述的硝酸纤维素膜上有两...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟运华，潘秀华，李春华，
申请(专利权)人：广州市微米生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：