一种无染料肉眼可识别的核酸培养检测计数方法技术

本发明专利技术公开了一种无染料肉眼可识别的核酸培养检测计数方法，属于数字化核酸培养技术领域。所述方法包括：(1)往待测样品环介导等温扩增反应体系中加入水凝胶单体丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺，引发交联形成水凝胶体系；(2)等温扩增反应；(3)扩增结束后，对水凝胶体系中形成的焦磷酸镁沉淀点进行识别计数，计算得出待测样品中的目标核酸分子的浓度。本发明专利技术将聚丙烯酰胺水凝胶和数字LAMP结合起来，利用PAM的吸附絮凝能力将LAMP反应副产物焦磷酸镁沉淀控制在核酸扩增团附近，形成与背景有明显颜色差别的白点，而且位置和大小跟核酸扩增团基本一致，实现了无染料肉眼可识别的核酸培养计数效果。数效果。数效果。

【技术实现步骤摘要】
一种无染料肉眼可识别的核酸培养检测计数方法


[0001]本专利技术涉及数字化核酸培养
，具体涉及一种无染料肉眼可识别的核酸培养检测计数方法。

技术介绍

[0002]传统的平板培养方法被视为微生物培养和计数的“金标准”，广泛应用于微生物的定量检测，筛选分离以及纯培养等方面。同样，核酸的培养(扩增)方法被广泛应用于临床、环境、农业等领域，在病原体感染的鉴定和遗传分析中发挥着重要作用。
[0003]实时聚合酶链式反应(Real
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time polymerase chain reaction,qPCR)和数字聚合酶链式反应(digital PCR,dPCR)已成为核酸检测的主要方法，但前者只能进行相对定量且需要参考标准曲线。dPCR法通过一定技术将样品等分成无数微量反应体系，每个体系含有不超过一个模板分子，扩增后根据微量反应体系中有无模板分子的荧光信号进行计数，革命性地实现了对样品的绝对定量。
[0004]然而，目前的dPCR方法往往需要精密的微流控设备，液滴生成、扩增和结果读取操作较为复杂。更重要的是，通过肉眼本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无染料肉眼可识别的核酸培养检测计数方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测样品加入到环介导等温扩增反应体系溶液中，再往反应体系中加入水凝胶单体，引发交联形成水凝胶体系；所述水凝胶单体包括丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺，所述环介导等温扩增反应体系包括特异性扩增目标核酸分子的引物；(2)将水凝胶体系置于等温条件下加热进行环介导等温扩增反应；(3)扩增结束后，对水凝胶体系中形成的焦磷酸镁沉淀点进行识别计数，计算得出待测样品中的目标核酸分子的浓度。2.如权利要求1所述的核酸培养检测计数方法，其特征在于，步骤(1)中，将含有水凝胶单体的反应体系注入密封小室中交联成胶，形成水凝胶体系，所述密封小室的厚度为250～300μm。3.如权利要求1所述的核酸培养检测计数方法，其特征在于，所述丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为25～45：1，两者以总质量体积比5％～7％添加至反应体系中。4.如权利要求1或3所述的核酸培养检测计数方法，其特征在于，水凝胶交联成胶采用的引发剂为质量体积比0.05％的过硫酸铵，催化剂为体积比1％的四甲基乙二胺。5.如权利要求1所述的核酸培养检测计数方法，其特征在于，当扩增目标为DNA时，所述环介导等温扩增反应体系组成包括：1
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等温扩增缓冲液，6mM MgSO4，0.8mM dNTPs，80...

【专利技术属性】
技术研发人员：林星宇，方玫，罗自生，徐艳群，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：