一种无染料肉眼可识别的核酸培养检测计数方法技术

本发明专利技术公开了一种无染料肉眼可识别的核酸培养检测计数方法，属于数字化核酸培养技术领域。所述方法包括：(1)往待测样品环介导等温扩增反应体系中加入水凝胶单体丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺，引发交联形成水凝胶体系；(2)等温扩增反应；(3)扩增结束后，对水凝胶体系中形成的焦磷酸镁沉淀点进行识别计数，计算得出待测样品中的目标核酸分子的浓度。本发明专利技术将聚丙烯酰胺水凝胶和数字LAMP结合起来，利用PAM的吸附絮凝能力将LAMP反应副产物焦磷酸镁沉淀控制在核酸扩增团附近，形成与背景有明显颜色差别的白点，而且位置和大小跟核酸扩增团基本一致，实现了无染料肉眼可识别的核酸培养计数效果。数效果。数效果。

【技术实现步骤摘要】
一种无染料肉眼可识别的核酸培养检测计数方法


[0001]本专利技术涉及数字化核酸培养
，具体涉及一种无染料肉眼可识别的核酸培养检测计数方法。

技术介绍

[0002]传统的平板培养方法被视为微生物培养和计数的“金标准”，广泛应用于微生物的定量检测，筛选分离以及纯培养等方面。同样，核酸的培养(扩增)方法被广泛应用于临床、环境、农业等领域，在病原体感染的鉴定和遗传分析中发挥着重要作用。
[0003]实时聚合酶链式反应(Real
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time polymerase chain reaction,qPCR)和数字聚合酶链式反应(digital PCR,dPCR)已成为核酸检测的主要方法，但前者只能进行相对定量且需要参考标准曲线。dPCR法通过一定技术将样品等分成无数微量反应体系，每个体系含有不超过一个模板分子，扩增后根据微量反应体系中有无模板分子的荧光信号进行计数，革命性地实现了对样品的绝对定量。
[0004]然而，目前的dPCR方法往往需要精密的微流控设备，液滴生成、扩增和结果读取操作较为复杂。更重要的是，通过肉眼对培养结果进行直观分析仍然具有挑战性。具体来说，目前的技术通常使用荧光指示剂标记目标物来实现计数，因此需要额外的染料和精密的光学设备。然而这些荧光染料同时也会抑制扩增效率，从而导致假阴性结果。
[0005]近年来出现了许多无标记检测方法，用于实现简单高效的数字扩增技术。例如，基于元素标记ICP
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MS技术的数字LAMP分析已被用于实现核酸的绝对定量，但该分析的仪器要求极高，实验难度大，限制了其在偏远地区的应用。此外，一种在核酸扩增反应中生成的副产物沉淀(焦磷酸镁)被视为核酸反应以及核酸定量的标志物，通过对反应过程中反应体系浊度的实时监测，可以实现模板核酸的定性和粗略定量；通过观察数字化微液滴中是否含有该副产物沉淀亦可判断其是否为阳性液滴。然而此法产生的沉淀无法直接通过肉眼进行观察，仍然需要显微放大技术和复杂的实验操作来实现精确的量化，反应体系混合物的乳状浑浊影响了图像的清晰度；微小液滴的超短光程也阻碍了沉淀物的准确识别。前期研究表明，水溶液反应体系中生成焦磷酸镁沉淀的速度较慢且倾向于沉积聚集，使得阳性水相液滴难以通过肉眼直接观测，加大了无染料肉眼可识别的核酸定量方法的应用难度。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种无染料肉眼可识别的核酸培养检测计数方法，无需借助复杂的检测仪器即可实现对目标核酸进行肉眼识别定量的现场快速检测。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种无染料肉眼可识别的核酸培养检测计数方法，包括以下步骤：
[0009](1)将待测样品加入到环介导等温扩增反应体系溶液中，再往反应体系中加入水凝胶单体，引发交联形成水凝胶体系；所述水凝胶单体包括丙烯酰胺(MA)和亚甲基双丙烯酰胺(BMA)，所述环介导等温扩增反应体系包括特异性扩增目标核酸分子的引物；
[0010](2)将水凝胶体系置于等温条件下加热进行环介导等温扩增反应；
[0011](3)扩增结束后，对水凝胶体系中形成的焦磷酸镁沉淀点进行识别计数，计算得出待测样品中的目标核酸分子的浓度。
[0012]具体的，所述待测样品为含有病原菌或核酸分子的样品，可以为食品、果蔬、环境废水等。所述病原菌可以为食源性致病菌或环境病原菌。
[0013]当待测目标为微生物时，可以先进行样品预处理，提取核酸物质制得待测样品后进行培养以及可视化定量检测。也可以直接加入反应体系中进行培养检测。
[0014]本专利技术根据目标核酸分子设计配套的LAMP引物。
[0015]步骤(1)中，制备待测物的聚丙烯酰胺(PAM)
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LAMP反应体系混合物。
[0016]PAM水凝胶作为由大量水和交联聚合物网络组成的三维网状结构的生物材料，具有亲水性、生物相容性、生物降解性和无毒等重要特性。其纳米级的多孔特性类似于微流控芯片的物理分隔，意味着不需要复杂的芯片制备和流体控制即可实现核酸的相对分隔。同时，PAM水凝胶具有极性酰胺基团，易于借助氢键作用吸附固体颗粒表面，并通过架桥作用形成大颗粒絮凝体。因此该水凝胶对于LAMP反应过程中生成焦磷酸镁沉淀具有优良的促絮凝效果。本专利技术利用PAM水凝胶纳米孔尺寸使得核酸扩增反应的产物在原位积聚，利用PAM水凝胶良好的吸附絮凝能力实现扩增副产物焦磷酸镁沉淀在核酸扩增团区域大量积累，形成与扩增团位置、大小均一一对应的白色斑点，从而实现可视化定量检测致病菌及目标核酸的方法。
[0017]所述密封小室为由载玻片和孵化小室贴合制成简易芯片，水凝胶成胶和等温扩增反应在密封小室内完成，无需复杂的微流体加工过程。不仅方便了技术人员的实际操作，也简化了实验流程，进而实现快速检测的目的。
[0018]作为优选，将含有水凝胶单体的反应体系注入密封小室中交联成胶形成水凝胶体系，所述密封小室的厚度为250～300μm。
[0019]具体地，将混合后的体系溶液滴加到透明的密封小室中，盖上密封片，静置成胶。密封小室和密封片构成的密封体系可以防止水凝胶中的水分蒸发，保证检测结果的准确性。基于核酸扩增团直径约300μm，水凝胶体系的厚度在250～300μm，使得核酸扩增团在水凝胶体系中呈单层分布，方便计数。
[0020]本专利技术采用聚丙烯酰胺水凝胶作为反应基质，研究表明，相较于聚乙二醇基水凝胶，聚丙烯酰胺水凝胶更有利于核酸扩增副产物焦磷酸镁沉淀絮凝积淀形成界限清晰的白色斑点。
[0021]聚丙烯酰胺凝胶通过使用过硫酸铵作为引发剂，并经由四甲基乙二胺催化MA与BMA之间的交联而形成。
[0022]通过调节PAM水凝胶中聚合物或交联剂的浓度获得合适的纳米孔尺寸，并优化扩增条件，通过PAM纳米多孔结构的限域功能实现核酸分子及其扩增产物的相对分隔，通过PAM良好的吸附絮凝能力实现扩增副产物焦磷酸镁沉淀的大量产生与积淀。作为优选，所述MA和BMA的摩尔比为25～45：1，两者以总质量体积比5％～7％添加至反应体系中。更为优选，反应体系中MA的浓度为0.668M，BMA的浓度为0.0243M。
[0023]作为优选，水凝胶交联成胶采用的引发剂为质量体积比0.05％的过硫酸铵，催化剂为体积比1％的四甲基乙二胺。
[0024]研究表明，LAMP反应试剂浓度条件(主要是dNTPs，MgSO4)以及PAM单体(MA&BMA)会影响各核酸扩增团处形成的白色斑点之间分隔界限的清晰度。作为优选，当扩增目标为DNA时，所述环介导等温扩增反应体系组成包括：1
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等温扩增缓冲液，6mM MgSO4，0.8mM dNTPs，800U/mL Bst 2.0DNA聚合酶，1.2mg/mL BSA和引物混合物，所述引物混合物为1.6μM FIB和BIP，0.2μM F3和B3，0.8μM LF和LB的混合物。
[0025]当检测目标为微生物如食源性致病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无染料肉眼可识别的核酸培养检测计数方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测样品加入到环介导等温扩增反应体系溶液中，再往反应体系中加入水凝胶单体，引发交联形成水凝胶体系；所述水凝胶单体包括丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺，所述环介导等温扩增反应体系包括特异性扩增目标核酸分子的引物；(2)将水凝胶体系置于等温条件下加热进行环介导等温扩增反应；(3)扩增结束后，对水凝胶体系中形成的焦磷酸镁沉淀点进行识别计数，计算得出待测样品中的目标核酸分子的浓度。2.如权利要求1所述的核酸培养检测计数方法，其特征在于，步骤(1)中，将含有水凝胶单体的反应体系注入密封小室中交联成胶，形成水凝胶体系，所述密封小室的厚度为250～300μm。3.如权利要求1所述的核酸培养检测计数方法，其特征在于，所述丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为25～45：1，两者以总质量体积比5％～7％添加至反应体系中。4.如权利要求1或3所述的核酸培养检测计数方法，其特征在于，水凝胶交联成胶采用的引发剂为质量体积比0.05％的过硫酸铵，催化剂为体积比1％的四甲基乙二胺。5.如权利要求1所述的核酸培养检测计数方法，其特征在于，当扩增目标为DNA时，所述环介导等温扩增反应体系组成包括：1
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等温扩增缓冲液，6mM MgSO4，0.8mM dNTPs，80...

【专利技术属性】
技术研发人员：林星宇，方玫，罗自生，徐艳群，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：