一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒技术方案

本申请公开了一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒，涉及检测技术领域。本申请包括以下步骤：1)基于不同的活性，设计合成不同类型用于扩增靶基因的引物，并在相关区域设计对应的探针；2)将基于不同活性以及不同类型引物酶系及其buffer、引物和DNA探针进行混合，得到反应混合物，并加入至相应模板即可；3)反应混合物进行反应后，以稀释液稀释10倍后插入CAS核酸试纸条，进行检测结果可视化判读。本申请相比于市面上现有的核酸试纸条检测技术，本发明专利技术具有以下优点：更快速：从取样到结果判断仅需22min，其中样本处理5min以内，扩增15min，试纸条检测2min。试纸条检测2min。试纸条检测2min。

【技术实现步骤摘要】
一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒


[0001]本申请涉及检测
，具体涉及一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒。

技术介绍

[0002]核酸诊断技术具有快速、灵敏的优势，能够检测处于潜伏期的病原体。目前，大多数实验室采用聚合酶链式反应(PCR)作为分子检测的金标准，被广泛应用于医学诊断、食品安全检测等领域。采用PCR扩增后，微量的待测物可被放大为初始浓度的约108倍，大大提高了检测灵敏度。但是PCR扩增需要集成精密温控热块，价格昂贵，非便携，不适用于现场检测。此外，PCR扩增通常需要1～2小时，非常耗时。
[0003]近年来出现了如RPA(RecombinasePolymeraseAmplification，重组酶聚合酶等温扩增)，LAMP等多种恒等温扩增技术，可用于现场检测，但如何准确特异地检测扩增产物一直是制约其发展的因素。目前RPA扩增可结合探针检测扩增产物，探针的引入可阻碍扩增反应的进行，因此该方法对引物探针组合筛选要求极高，难以达到快速应对突发疫情的目的。并且探针法本身并未改变其单级扩增反应的本质，相较于目前市场上的实时定量PCR(Q
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PCR)方法，并未实质性地提升检测灵敏度。LAMP扩增反应体系较复杂，已有的终端检测方式(如显色法、荧光法及核酸试纸条等)均不同程度地显示出假阳性。因此亟待建立一种特异地，可应用于现场、简易、快速、且高灵敏度的检测技术，近年来发展起来的CRISPR/Cas检测技术成为理想的候选方案。
[0004]CRISPR是大多数细菌及古细菌中抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式。当病毒入侵时，细菌生成对应的能识别病毒基因组的crRNA，该crRNA引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白对病毒靶标序列进行识别和切割。
[0005]2016年6月，张锋课题组发现了一种CRISPR效应蛋白Cas13a。该蛋白是一种在crRNA引导下与靶标RNA结合并降解靶标的核酸内切酶(Makarovaetal.,2011)。同年10月Doudna等(East
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Seletskyetal.,2016)发现一种叫LeptotrichiabuccalisCas13a(LbuCas13a)的核酸内切酶不仅具有对靶标RNA切割活性，而且还具有切割非靶标RNA的活性，这种非特异性切割称为反式切割。利用这种特性，该研究组将Cas13a用于检测RNA靶标但其检出限仅为10pmol/L。这对核酸检测来说不具有应用价值，因为大多数核酸检测方法检出限都在amol/L数量级(Songetal.,2013)。2017年，张锋与Collins合作将Cas13a与重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)结合，开发出了一个高特异性和灵敏性的核酸检测系统(Specific High
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Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing，SHERLOCK)(Gootenberg et al.,2017)。该检测系统中，靶标经RPA和T7RNA聚合酶转录扩增后，在对应的crRNA的引导下，能特异性地识别并切割靶标RPA分子，同时激活LwCas13a的非特异性单链RNA酶活性，切割底物产生荧光信号。RPA的引入显著地提高了该系统的灵敏度，SHERLOCK对靶标的检出限低至2x103copies/mL，实现了单分子的检测。这项
突破性的研究成果再次证实了CRISPR/Cas系统在核酸诊断领域的价值，有望在公共卫生领域产生重大影响。但是环境中的核糖核酸酶(RNase)广泛存在且十分稳定，而SHERLOCK系统的关键组分均为RNA链，因此该系统对操作环境要求较为苛刻。2015年，张锋等发现一种Ⅱ类V型CRISPR效应蛋白Cas12(Zetsche et al.，2015)。Cas12可在crRNA引导下与靶标双链DNA结合并切割基因组DNA。2018年，Doudna等发现当Cas12特异性结合和切割目标dsDNA后，具有非特异性切割单链DNA(ssDNA)的活性，并利用Cas12的这种活性开发了一个被命名为DETECTR的核酸检测系统。DETECTR将RPA等温扩增技术与Cas12相结合，扩增产物激活Cas12的附属切割活性，切割底物产生荧光信号，并且实现了单分子级别的灵敏度。该系统在单核苷酸多态性分析、肿瘤筛查、细菌和病毒感染检测以及耐药性筛查等方面有广泛的应用潜力。由于cas12的靶标及底物均为DNA，稳定性较强，因此该系统对实验操作环境要求低，可应用于现场的快速检测。同时由于Cas12被靶标特异性激活后，能够非特异性地切割单链报告分子，该步骤具有信号放大作用，因而该技术相较于单一的探针法等传统核酸检测技术具有更高的灵敏度。
[0006]以上技术及技术的组合尽管可以实现核酸分子的快速灵敏检测。但基于荧光的方法需要复杂、大型且价格昂贵、做工精密的光学仪器，不利于设备的小型化和降低成本，并且结果不能可视化的判读，这对该类技术在基层检验机构的普及带来困难。现有的核酸试纸条层析法大多基于PCR、RPA及LAMP等扩增产物的显色而进行可视化判读，其体系中存在的引物二聚体和非特异扩增等会促成假阳性结果；而CRISPR系统需先扩增再进行CAS切割，分步进行一方面增加了操作的复杂度，亦增加了整个检测过程的时长，同时开盖操作极易形成气溶胶，造成核酸实验室的污染，不利于临床应用。即使可实现“扩增+CAS”系统的一步法，但整个体系所需物料过多，增加了产品化的可行性及成本,鉴于此，本申请提出一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒新冠病毒检测试剂盒。

技术实现思路

[0007]本申请的目的在于：为解决上述
技术介绍
中提出的问题，本申请提供了一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒。
[0008]本申请为了实现上述目的具体采用以下技术方案：
[0009]一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法，包括以下步骤：
[0010]1)基于不同的活性，设计合成不同类型用于扩增靶基因的引物，并在相关区域设计对应的探针；
[0011]2)将基于不同活性以及不同类型引物酶系及其buffer、引物和DNA探针进行混合，得到反应混合物，并加入至相应模板即可；
[0012]3)反应混合物进行反应后，以稀释液稀释10倍后插入CAS核酸试纸条，进行检测结果可视化判读。
[0013]进一步地，所述步骤1)中不同的活性包括5
’→3’
核酸外切酶活性、Exonuclease III活性或Endonuclease IV活性。
[0014]进一步地，所述步骤1)中不同的活性还包括RNase HII活性。
[0015]进一步地，当活性为5
’→3’
核酸外切酶活性时，此时引物类型为PCR引物和LAMP引物、RCA引物中的一种或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)基于不同的活性，设计合成不同类型用于扩增靶基因的引物，并在相关区域设计对应的探针；2)将基于不同活性以及不同类型引物酶系及其buffer、引物和DNA探针进行混合，得到反应混合物，并加入至相应模板即可；3)反应混合物进行反应后，以稀释液稀释10倍后插入CAS核酸试纸条，进行检测结果可视化判读。2.根据权利要求1所述的一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法，其特征在于，所述步骤1)中不同的活性包括5
’→3’
核酸外切酶活性、ExonucleaseIII活性或EndonucleaseIV活性。3.根据权利要求2所述的一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法，其特征在于，所述步骤1)中不同的活性还包括RNaseHII活性。4.根据权利要求3所述的一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法，其特征在于，当活性为5
’→3’
核酸外切酶活性时，此时引物类型为PCR引物和LAMP引物、RCA引物中的一种或几种；当活性为ExonucleaseIII活性或EndonucleaseIV活性时，此时引物类型为RPA引物；当活性为RNaseHII活性时，此时引物类型为PCR引物、RPA引物、LAMP引物和RCA引物中的一种或几种。5.根据权利要求2所述的一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，DNA探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合，当活性为ExonucleaseIII活性或EndonucleaseIV活性时，DNA探针中间某碱基以四氢呋喃THF替代。6.一种新冠病毒检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1
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5任意一项所述的一种可替代CRISPR系统的核酸试纸条检测方法，至少还包括引物、DNA探针和CAS核酸试纸条。7.根据权利要求6所述的一种新冠病毒检测试剂盒，其特征在于，当活性为5
’→3’
核酸外切酶活性时，试剂盒还包括完整的Bst聚合酶及其buffer；当活性为ExonucleaseIII活性或EndonucleaseIV活性时，试剂盒还包括RPA酶系及其buffer、醋酸镁；当活性为RNas...

【专利技术属性】
技术研发人员：许萍，
申请(专利权)人：许萍，
类型：发明
国别省市：