一种等温识别双链DNA的核酸探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种等温识别双链DNA的核酸探针及其应用。通过针对待测序列靶向设计对应的检测引物系列，在T4DNA连接酶扩增耦合体系中实现高度同源序列的区分和前端放大，并与磁珠偶联进行提纯，然后利用Exo III核酸外切酶实现信号的放大和读取。本发明专利技术所述技术方案的检测灵敏度可以达到1amol/L，特异性可以达到识别单个碱基的差异的核酸片段。不需要复杂昂贵的温控设备就可实现待测物在同一管中同时指数扩增和特异性高效甄别，高灵敏、准确地检测区分高度同源的基因，快速得到检测结果。本发明专利技术具有普适性，在单管实现高灵敏高特异性快速完全等温操作适用于即时检验。速完全等温操作适用于即时检验。速完全等温操作适用于即时检验。

【技术实现步骤摘要】
一种等温识别双链DNA的核酸探针及其应用


[0001]本专利技术涉及双链DNA识别
，特别涉及一种等温识别双链DNA的核酸探针及其应用。

技术介绍

[0002]截止2022年9月8日，目前国内外相关生物公司基于猴痘核酸检测的产品主要集中于逆转录
‑
聚合酶链反应(RT
‑
PCR)相关试剂的研发和供给，极少数提供Bst DNA聚合酶等常温扩增酶类。
[0003]诚然，实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)一直是各种流行传染病毒检测的金标准，但是其对仪器和温度精准控制的高度依赖性，极大限制了这种检测方法广泛使用。对于那些落后地区，特别是疾病发病率较高的地方
‑
西非等地区，广泛使用qPCR定性检测病毒DNA变得不切实际。
[0004]另一方面，对于流行传染病的溯源一直是疾病控制的一大难点，它涉及到对于高度同源序列的比对与区分。特别是猴痘，目前在2022年自然医学期刊最新发表的一篇论文中对于2022年猴痘爆发进行进化枝和谱系分析，得出2022MPXV与相关2018
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2019病毒的平均差异为50个单核苷酸多态性(SNP)，比预期的要多。考虑到先前对正痘病毒替代率的估计，这种不同的分支可能代表着病毒在加速进化。这一研究无疑揭示了单核苷酸多态性检测的对于研究猴痘病毒进化和溯源的重要性，而这些在目前发表的期刊论文、已经上市和即将上市的产品中都没有任何体现。
[0005]因此，本申请将拓展核酸快速检测方法，弥补当前检测不足，针对对多种高度同源序列的高特异性区分性差的问题，摆脱对昂贵检测仪器的依赖，实现等温体外快速检测。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：为了解决传统检测各类流行性传染疾病，如猴痘或者新冠等基因样本对PCR仪器的高度依赖性以及简化流行性疾病溯源和进化树分析，解决检测过程中突变频率手续复杂，检测时间长，检测成本高的问题，本专利技术提供了一种用于快速实现等温扩增并且实现高灵敏高特异性检测各类高度同源序列的多重检测，可以快速判读样本中DNA是否是目标基因，并且区分高度同源序列，为医生的诊断提供准确的科学依据，降低了检测时间和成本，提出一种等温识别双链DNA的核酸探针及其应用。
[0007]本专利技术的技术方案：
[0008]一种等温识别双链DNA的核酸探针，包括：
[0009]检测体系：所述检测引物包括检测引物和检测试剂；所述检测引物为待测序列前段引物(Fw探针)、待测序列纯化引物(BP探针)和待测序列后端放大引物(AP探针)，所述检测试剂包括T4 DNA连接酶、MgOAC、缓冲液和RPA干粉；
[0010]纯化磁珠：所述纯化磁珠为链霉亲和素磁珠；
[0011]二次放大体系：所述二次放大体系包括ExoIII核酸外切酶和待测序列的荧光报告
探针。
[0012]在一些实施方案中，所述前段引物的碱基长度为18～24个，包括40～60％的G/C含量，熔化温度50～60℃；
[0013]在一些实施方案中，所述纯化引物位于后端放大引物上游，与后端放大引物头尾相连无任何间隔，所述纯化引物5端序列修饰磷酸基团，3端序列修饰生物素且与待测序列模板互补配对；纯化引物碱基长度为18～24个，包括40～60％的G/C含量，熔化温度50～60℃；
[0014]在一些实施方案中，所述后端放大引物具有一段互补配对片段和一段非互补配对片段；所述互补配对片段对与待测序列检测位点互补配对，碱基长度为18～24个，包括40～60％的G/C含量，熔化温度50～60℃；所述非互补配对片段，无任何GC序列；长度为18～27个碱基长度；
[0015]在一些实施方案中，所述荧光报告探针与后端放大引物互补配对，长度为18nt；3端为荧光基团，间隔三或四个碱基后是猝灭基团。
[0016]在另一方面，本专利技术还提供了如上所述的等温识别双链DNA的核酸探针的应用，包括如下步骤：
[0017]1)根据待测基因设计前段引物，纯化引物，后端放大引物和荧光报告探针；
[0018]2)将待测基因配置成待测溶液，取待测溶液、待测序列前段引物、待测序列纯化引物和待测序列后端放大引物、T4 DNA连接酶、MgOAC、缓冲液和RPA干粉混合均匀，进行扩增反应(即T4连接等温扩增耦合反应体系)；
[0019]3)上述反应结束后，将反应产物与链霉亲和素磁珠混合进行孵育，孵育结束后用孵育缓冲液清洗磁珠进行纯化；
[0020]4)取出链霉亲和素磁珠，直接向链霉亲和素磁珠中加入ExoIII核酸外切酶和荧光报告探针进行二次放大反应，置于酶标仪下获取荧光读数。
[0021]在一些实施方案中，所述待测溶液浓度为为1aM～10nM；优选地，其中将检测结果进行线性划分，单独抽取所述待测溶液浓度在100aM～1pM时的结果，发现对应结果在此区间内具有线性关系。
[0022]在一些实施方案中，所述待测溶液、前段引物、纯化引物、后端放大引物的浓度比为1～2：1～2：1～2：1.25～2；T4 DNA连接酶终浓度：10～20U。
[0023]在一些实施方案中，所述扩增反应的反应温度为35～38℃，反应时间为30～60min。
[0024]在一些实施方案中，所述链霉亲和素磁珠直径为1～10μm，修饰有链霉亲和素。
[0025]在一些实施方案中，所述孵育时间为15～30min。
[0026]在一些实施方案中，所述孵育缓冲液包括1xPBST孵育缓冲液和1xPBS孵育缓冲液；所述1xPBST孵育缓冲液包括，137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4和0.05％v/v(体积比)Tween
‑
20，pH为7.4；所述1xPBS孵育缓冲液包括，137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4和1.47mM KH2PO4，pH为7.4。
[0027]在一些实施方案中，所述用孵育缓冲液清洗磁珠进行纯化，包括先使用50～100μL1xPBST清洗两遍，再用50～75μL1 x PBS缓冲液清洗一遍。
[0028]在一些实施方案中，所述ExoIII核酸外切酶终浓度为10～20U/μL；荧光报告探针
终浓度为400～600nM。
[0029]在一些实施方案中，所述二次放大反应的反应温度为36～39℃，反应时间20～40min。
[0030]在一些实施方案中，当荧光基团为FAM荧光基团时，对应激发波长为494
±
10nm，发射波长为518
±
10nm；当进行多重检测时，可以有意选择不同波段的荧光基团，当发射波长不重叠时，可以实现多种待测物检测。进行荧光读数时，只有与引物匹配的待测序列才会产生高于阴性对照的荧光值，否则输出的荧光信号小于或者接近于阴性对照数值，根据荧光度数判断待测序列是否为目标序列。
[0031]有益效果：
[0032本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种等温识别双链DNA的核酸探针，其特征在于，包括：检测体系：所述检测体系包括检测引物和检测试剂；所述检测引物为待测序列前端引物、待测序列纯化引物和待测序列后端放大引物，所述检测试剂包括T4 DNA连接酶、MgOAC、缓冲液和RPA干粉；纯化磁珠：所述纯化磁珠为链霉亲和素磁珠；二次放大体系：所述二次放大体系包括ExoIII核酸外切酶和待测序列的荧光报告探针。2.根据权利要求1所述等温识别双链DNA的核酸探针，其特征在于，所述前端引物碱基长度为18～24个，包括40～60％的G/C含量，熔化温度50～60℃；所述纯化引物位于后端放大引物上游，与后端放大引物头尾相连无任何间隔，所述纯化引物5端序列修饰磷酸基团，3端序列修饰生物素且与待测序列模板互补配对；纯化引物碱基长度为18～24个，包括40～60％的G/C含量，熔化温度50～60℃；所述后端放大引物具有一段互补配对片段和一段非互补配对片段；所述互补配对片段对与待测序列检测位点互补配对，碱基长度为18～24个，包括40～60％的G/C含量，熔化温度50～60℃；所述非互补配对片段，无任何GC序列；长度为18～27个碱基长度；所述荧光报告探针与后端放大引物互补配对，长度为18nt；3端为荧光基团，间隔三或四个碱基后是猝灭基团。3.权利要求1～2任意一项所述等温识别双链DNA的核酸探针的应用，其特征在于，包括如下步骤：1)根据待测基因设计前端引物，纯化引物，后端放大引物和荧光报告探针；2)将待测基因配置成待测溶液，取待测溶液、待测序列前段引物、待测序列纯化引物和待测序列后端放大引物、T4 DNA连接酶、MgOAC、缓冲液和RPA干粉混合均匀，进行扩增反应；3)扩增反应结束后，将反应产物与链霉亲和素磁珠混合进行孵育，孵育结束后用孵育缓冲液清洗磁珠进行纯化；4)取出链霉亲和素磁珠，直接向链霉亲和素磁珠中加入Exo...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国珍，余湉，
申请(专利权)人：余湉，
类型：发明
国别省市：