一种用于扩增cDNA5制造技术

本发明专利技术公开了一种用于扩增cDNA 5

【技术实现步骤摘要】
一种用于扩增cDNA 5
’
末端的通用接头引物及5
’
RACE方法


[0001]本专利技术涉及cDNA末端扩增的
，具体而言，涉及一种用于扩增cDNA 5
’
末端的通用接头引物及5
’
RACE方法。

技术介绍

[0002]RACE(rapid
‑
amplification of cDNA ends)称为cDNA末端快速扩增技术，是一种快速克隆目的mRNA的3
’
或5
’
末端以获得mRNA全长的分子生物学技术。RACE技术以其独特的优势被应用于多个领域，如cDNA文库的建立、目的基因克隆、病毒基因组功能的研究、新的表达序列标签研发(expressed sequence tag,ESTs)等。随着分子生物学技术的发展，科学家结合其他不同的分子生物学技术对最初的RACE技术进行了改进，从而丰富了RACE技术的类型。目前使用的RACE技术包括：经典RACE、Adapter Ligated RACE、RLM RACE、Cap switching RACE、环形RACE和T
‑
RACE等。
[0003]5’
RACE基本原理：5
’
RACE是对基因未知5
’
末端进行扩增的技术。本专利技术先利用mRNA中的一段特异序列作为结合位点，以特异性的反转录引物在反转录酶作用下，合成第一链cDNA。在TdT酶作用下加上(dC)残基，退火后，(dC)残基与含有寡核苷酸序列的通用接头引物5
’
adaptor Primer配对，以特异引物R1作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增。然后用一个含有部分接头序列的通用引物5
’
RACE Outer Primer作为上游引物，以另一个特异引物R2作为下游引物，把目的基因5
’
末端的cDNA片段扩增出来。
[0004]目前常用的5
’
RACE实验方法有三种：接头连接法(adaptor ligation)、去帽法(oligo caping method)和末端转移酶法(terminaldeoxynucleotidyl transferase method，TdT method)。
[0005]接头连接法以SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech Code:634923)为代表。该方法原理是先利用mRNA的3
’
末端的poly(A)尾巴作为逆转录引物的结合位点，以Oligo(dT)作为逆转录引物，在逆转录酶作用下，合成第一链cDNA，该逆转录酶具有末端转移酶活性，在逆转录达到5
’
末端时自动加上3
‑
5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接头引物5
’
adaptor Primer配对进行PCR扩增反应，把目的基因5
’
末端的cDNA片段扩增出来。该方法的优点是操作简便，一次逆转录可以获得全部基因模板用于多个基因的5
’
RACE实验，RNA质量较高的前提下，获得全长分子比例高。cDNA第一链合成和加尾一步完成，最大限度降低了mRNA的降解风险；该方法的缺点是逆转录特异性低，无法精确获得感兴趣的基因，常呈现连续的模糊带或较短的产物背景。
[0006]去帽法以5'
‑
full RACE Kit(TaKaRa Code:D315)为代表。该方法原理是先利用mRNA的5
’
末端帽子结构特异性的对基因全长进行扩增。降解的mRNA 5
’
端有一个磷酸基团，用碱性磷酸酶去掉该磷酸基团。再用烟草酸性焦磷酸酶去掉帽子结构，则mRNA 分子的5
’
末端会暴露出磷酸基团，随后的连接步骤中，锚定引物5
’
Outer Primer特异性地加在mRNA 分子的5
’
末端而不会和降解的mRNA连接。该方法的优点是全长分子比例高，非特异性PCR产物较少；该方法的缺点是实验操作复杂，针对mRNA分子操作，增加了mRNA降解的风险，对于
mRNA 5
’
末端结构复杂或二级结构较多的基因，会导致实验失败，无法获得目的条带。
[0007]末端转移酶法以5
’
RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen Code:18374
‑
058)为代表。该方法原理是利用基因特异性逆转录引物，在逆转录酶作用下合成第一链cDNA，将RNA
‑
DNA杂合链中的RNA降解纯化后，在末端转移酶的作用下将poly(C)尾巴加在cDNA链的3
’
端，然后分别用接头引物5
’
adaptor Primer和基因特异性引物使用巢式PCR扩增目的基因。该方法的优点是经济实惠，无需特殊仪器设备，通常实验室可以自行完成，只需要设计一或两条特异性的逆转录引物及两条特异性的基因扩增引物，该方法使用的是特异性的逆转录引物，大大提高目的基因的扩增成功率。目前，末端转移酶法存在操作步骤多，扩增周期长，非特异性扩增产物多，而且由于扩增产物无法涵盖目的基因编码区5
’
端的完整信息，往往需要重复进行RACE过程。
[0008]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种用于扩增cDNA5
’
末端的通用接头引物及5
’
RACE方法以解决上述技术问题。
[0010]本专利技术是这样实现的：
[0011]第一方面，本专利技术提供了一种用于扩增cDNA5
’
末端的通用接头引物，5
’
末端的接头引物序列为：GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGIIGGIIGGII GGIIG，通用接头引物与3
’
端添加有poly(C)的单链cDNA片段的模板配对。
[0012]专利技术人提供了一种新的适用于扩增多物种的cDNA5
’
末端的通用接头引物，与原有的接头引物相比，改进后的接头引物在鸟嘌呤(G)中间插入两个脱氧次黄嘌呤(I)，使合成的接头序列长度增加；脱氧次黄苷(I)与四个碱基均能互补配对，但它与不同碱基具有不同的亲和力。稳定性顺序从高到低如下：I：C>I：A>I：T>I：G，选择性地在通用接头引物的3
’
端插入脱氧次黄苷(I)残基保持了引物3
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端的低稳定性，并使引物锚定区域Tm值在65℃以上。提高了通用接头引物与cDNA3
’
端oligo本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增cDNA 5
’
末端的通用接头引物，其特征在于，所述5
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末端的接头引物序列为：GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGIIGGIIGGII GGIIG，所述通用接头引物与3
’
端添加有poly(C)的单链cDNA片段的模板配对。2.一种扩增cDNA末端的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于扩增cDNA5
’
末端的通用接头引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增cDNA 5
’
末端的锚定引物，所述锚定引物的序列为：GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录酶、逆转录引物和巢式引物组；优选地，所述巢式引物组包括第一巢式引物和第二巢式引物，且所述第一巢式引物用于与所述通用接头引物组合进行第一轮巢式PCR，所述第二巢式引物与所述锚定引物进行第二轮巢式PCR；优选地，所述第一巢式引物和第二巢式引物的引物序列长度为23
‑
28nt，且所述第一巢式引物所在的位置和第二巢式引物所在的位置大于20nt。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应Buffer；所述反应Buffer包括1
‑
1.1M的二甲胂酸钾，1
‑
1.1M的KCl，200
‑
205mM Tris
‑
HCl，78
‑
80mM MgCl2，10
‑
12mM DTT，5
‑
6mM CoCl2，0.05％
‑
0.06％(v/v)Triton X
‑
100，其中Tris
‑
HCl的pH为7.8
‑
8...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冬，熊园，
申请(专利权)人：生工生物工程上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：