一种实时荧光恒温扩增检测m6A的方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种实时荧光恒温扩增检测m6A的方法与应用，属于生物检测技术领域。本发明专利技术提供一种实时荧光恒温扩增检测m6A的方法，本发明专利技术的实时荧光恒温扩增检测m6A的方法简便易操作，可在一个反应体系中完成扩增步骤且扩增条件易实现；本发明专利技术的实时荧光恒温扩增检测m6A的方法准确度高、差异明显，无假阳性结果，能使待测物中含m6A修饰的RNA的荧光值远高于不含m6A修饰的RNA的荧光值，荧光值差异可达10倍以上；本发明专利技术的实时荧光恒温扩增检测m6A的方法应用范围广，可用于包括mRNA，lncRNA，rRNA在内的多种RNA的m6A修饰的检测，也可用于m6A相关酶抑制剂筛选。相关酶抑制剂筛选。相关酶抑制剂筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种实时荧光恒温扩增检测m6A的方法与应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种实时荧光恒温扩增检测m6A的方法与应用。

技术介绍

[0002]m6A修饰是真核生物mRNA中的常见的修饰类型，参与了RNA代谢的各种关键过程，目前常使用的检测m6A的方法主要有MeRIP
‑
seq，PA
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m6A
‑
seq，miCLIP
‑
seq，SCARLET以及SELECT。MeRIP
‑
seq依赖于m6A抗体富集含m6A修饰的RNA片段，进行高通量测序后进行m6A的大概定位，只能进行高甲基化的大概定位，无法准确到单碱基定位。PA
‑
m6A
‑
seq、miCLIP
‑
seq使用紫外交联技术进行免疫沉淀，能够做到单碱基识别。目前仅有SCARLET和SELECT可用于单位点的m6A修饰检测。SCARLET用RNA酶H以及特定序列将需要测定的序列切断，然后将其用磷32标记，再特异性连接到一段DNA上，再用RNA酶切断所有RNA片段，剩下的是连接了待检测腺苷的DNA。然后通过跑胶分离该片段，再经过核酸酶P1将该片段裂解成单个核苷酸，再根据正常腺嘌呤以及m6A极性差异，通过TLC即可测定该位点是否有m6A。SELECT是一种基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增方法，该方法利用m6A能够阻碍DNA聚合酶的单碱基延伸活性和连接酶的缺口连接效率，最后通过PCR扩增后循环值的不同来确定m6A修饰，可做到单碱基识别。
[0003]MeRIP
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seq、PA
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m6A
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seq、miCLIP
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seq均依赖于m6A抗体，检测过程复杂，重复性低，价格昂贵；SCARLET操作耗时，且需要进行放射性标记，价格昂贵，操作难度高。SELECT对照位点和检测位点循环值差异较小，且在酶连过程中可能发生非配对引物的自连从而普遍存在假阳性现象。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种简便易操作，实用性强，准确度高，灵敏度好的实时荧光恒温扩增检测m6A的方法与应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种实时荧光恒温扩增检测m6A的方法，包括以下步骤：
[0006](1)提取样本的RNA并进行酶切处理，获得酶切片段；
[0007](2)针对检测位点设计特异性探针；所述特异性探针的一端含有荧光基团，另一端含有猝灭基团；所述特异性探针的碱基序列与待测RNA片段的部分序列相同；与扩增产物序列互补配对；所述特异性探针两臂的序列不低于4个碱基，且两臂序列互补配对；
[0008](3)针对待测RNA片段设计特异性引物；
[0009](4)针对非m6A修饰位点设计对照探针和对照引物；
[0010](5)将特异性探针和特异性引物、对照探针和对照引物、分为两组与酶切片段、T7 RNA聚合酶和M
‑
MuLv逆转录酶加入扩增检测液进行实时荧光定量扩增反应，通过比较两组扩增反应的荧光值判断是否存在m6A修饰。
rRNA上m6A位点的实验结果图。
具体实施方式
[0026]为了更加简洁明了的展示本专利技术的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本专利技术的技术方案。
[0027]实施例1
[0028]本实施例提供一种实时荧光恒温扩增检测m6A的方法，具体步骤如图1所示，具体为：
[0029](1)提供待测RNA序列为：Oligo2:GTGTATATAAGCGCAGAAGGCTTGGAATGAGTAGACAATTGGAGCCTGATATAGAAGCTATGTTATTCCAAGG(m6A)CATGTCAAGGAAGTAATATCAGA其中，m6A为m6A；A为对照位点；取3.75pmol(3.75_μl)RNA Oligo2(1μM)，加入5U MazF酶、3μl 5
×
MazF Buffer、DEPC水补齐至15μl,于37℃进行酶切反应30min，80℃，10min失活；
[0030](2)根据步骤(1)的待测RNA序列设计特异性m6A位点探针为：5
′‑
FAM
‑
CCAGGCUAUGUUAUUCCCUGG
‑
DABCYL
‑3′
(SEQ ID NO:1)；特异性m6A位点引物为：上游引物：5
′‑
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATCTGATATT(SEQ ID NO:2)；下游引物：5
′‑
CAATTGGAGCCTGATATA
‑3′
(SEQ ID NO:3)；对照A位点探针：5
′‑
FAM
‑
CCAGUUGGAAUGAGUACUGG
‑
DABCYL
‑3′
(SEQ ID NO:4)；对照引物：上游引物：5
′‑
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCTTCTATATCAGGCTCCAA
‑3′
[0031](SEQ ID NO:5)；下游引物：5
′‑
TGTATATAAGCGCAGAAG
‑3′
(SEQ ID NO:6)；
[0032](3)配制后续SAT反应体系：40mM Tris
‑
HCl、8mM MgCl2、25mMNaCl、2mM亚精胺、5mM DTT、80μg/ml牛血清白蛋白、200μM dNTP、1mM NTP、500nM引物，125nM探针，每个体系加入13.5μl步骤(1)中酶切后的产物，于60℃加热10min，于42℃加热5min；
[0033](3)每个样品3个复孔，每孔再加入4ul扩增酶混合物，其中含有10UM
‑
MuLV逆转录酶和10U T7 RNA聚合酶；
[0034](4)于42℃反应，监测荧光值或水浴锅反应2小时后检测荧光值。
[0035]实验结果：由图2可以看出，Oligo2对照位点A的引物的扩增效率以及扩增后的荧光值远低于Oligo2
‑
m6A位点，证明MazF可有效切断ACA序列而无法切断m6ACA序列，ACA序列被切断后RNA无法有效扩增，而未被切断的m6A位点附近的RNA片段仍能有效扩增，探针与RNA结合，发出荧光。在人工合成的RNA中，本方法可以准确检测到m6A位点。
[0036]实施例2
[0037]本实施例通过实验验证实施例1的实时荧光恒温扩增检测m6A的方法在混合体系中能准确检测m6A位点，具体实验方法如下：
[0038](1)由公司合成以下序列：
[0039]Oligo
‑1‑
m6A:
[004本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种实时荧光恒温扩增检测m6A的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样本的RNA并进行酶切处理，获得酶切片段；(2)针对检测位点设计特异性探针；所述特异性探针的一端含有荧光基团，另一端含有猝灭基团；所述特异性探针的碱基序列与待测RNA片段的部分序列相同，与扩增产物序列互补配对；所述特异性探针两臂的序列不低于4个碱基，且两臂序列互补配对；(3)针对待测RNA片段设计特异性引物；(4)针对非m6A修饰位点设计对照探针和对照引物；(5)将特异性探针和特异性引物、对照探针和对照引物分为两组与酶切片段、T7RNA聚合酶和M
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MuLv逆转录酶加入扩增检测液进行实时荧光定量扩增反应，通过比较两组扩增反应的荧光值判断是否存在m6A修饰。2.根据权利要求1所述的实时荧光恒温扩增检测m6A的方法，其特征在于，所述酶切处理采用MazF酶。3.根据权利要求1所述的实时荧光恒温扩增检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红胜，吴优，钟科，黎婕昕，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：