System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind() 一种荧光微球的制备方法技术_技高网
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一种荧光微球的制备方法技术

技术编号：40326696 阅读：9 留言：0更新日期：2024-02-09 14:20
本发明专利技术公开了一种荧光微球的制备方法，荧光微球的制备方法先利用单分散聚合技术合成种子微球，再利用两步溶胀法制备得荧光微球。利用该方法获得的荧光微球的发射光谱至少覆盖流式细胞仪的FITC、PE及APC三个检测通道，微球稳定性好，粒径均一。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及功能高分子材料领域，更具体为，本专利技术涉及一种荧光标记微球的制备方法。


技术介绍

1、免疫功能与每个人的健康状态息息相关，而淋巴细胞亚群分析正是检测免疫功能的重要指标，它能反映机体当前的免疫功能、状态和平衡水平，并可以辅助诊断某些疾病，对分析发病机制，观察疗效及检测预后都有重要意义。

2、流式细胞术（flow cytometry，fcm），可用于细胞的计数和分选，很多临床检验都需要使用荧光微球以精确计量细胞的个数，流式细胞术是淋巴细胞亚群检测的标准方法。利用流式细胞术分析淋巴细胞亚群水平，可以帮助评价机体免疫状态，是目前广泛应用于临床各领域的重要检测指标，在淋巴细胞亚群结果判别中既要判别相对计数的变化，也要判别绝对计数的变化。绝对计数微球可以用来计算混合复杂的细胞群体中目的细胞群的绝对细胞数量，绝对计数微球是一种已知数量或浓度的微球，它可在较宽范围内的激发和发射波长下发出明亮荧光。

3、目前，现有的制备方法得到的绝对计数用荧光微球普遍存在荧光微球不稳定，不能长期保存，发射光谱不能覆盖常用流式细胞仪检测通道等问题。因此，有必要开发一种制备稳定性好、能覆盖常用流式细胞仪检测通道的荧光微球的方法，有助于提高科研、临床检测的准确性及便利性。


技术实现思路

1、为解决以上问题，本专利技术提供了一种荧光微球的制备方法，获得的微球稳定性好，能至少覆盖流式细胞仪的fitc、pe及apc三个检测通道。为获得上述荧光微球，本专利技术所采用的技术方案如下：

2、根据本专利技术优选的，一种荧光微球的制备方法，步骤如下：

3、（1）采用分散聚合技术合成种子微球；

4、（2）将种子微球、溶胀剂加入到十二烷基硫酸钠溶液中，超声乳化，加入到反应器中加热进行第一次溶胀；

5、（3）将引发剂、苯乙烯单体、交联剂单体、羧基单体、致孔剂、复合染料、十二烷基硫酸钠水溶液混合均匀后，加入到上述体系中，加热进行第二次溶胀；

6、（4）向体系中加入稳定剂水溶液、水相阻聚剂，惰性气体保护下升温反应。

7、进一步地，所述种子微球为聚苯乙烯微球。

8、进一步地，所述溶胀剂为邻苯二甲酸二丁酯、环己烷、正己烷、四氯甲烷、氯仿、二氯甲烷、甲苯、四氢呋喃中的一种或几种。

9、进一步地，所述十二烷基硫酸钠水溶液浓度为0.1%~1 wt%。

10、进一步地，所述引发剂为过氧化苯甲酰、过氧化二碳酸二异丙酯、过氧化二碳酸二环己酯、过氧化二碳酸双(4-叔丁基环己基)酯中的一种。

11、进一步地，所述交联剂单体为二乙烯基苯、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的一种。

12、进一步地，所述羧基单体为马来酸酐、丙烯酸、甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯中的一种。

13、进一步地，所述致孔剂为甲苯、正己烷、环己烷、氯仿中的一种或几种。

14、进一步地，所述复合染料选自异硫氰酸荧光素、吖啶橙、派洛宁、罗丹明110、罗丹明b、尼罗红、尼罗蓝等有机染料中的两种或两种以上组合而成，且组合成的复合染料的发射波长能够至少覆盖fitc、pe及apc三个通道。

15、进一步地，优选为尼罗蓝、吖啶橙、异硫氰酸荧光素三种染料的复合染料，三种复合染料的质量比1:1:1~1:2:5

16、进一步的，所述复合染料溶解于无水乙醇中，配制成浓度为0.1~10 mg/ml浓度，滴加方式加入反应体系中。

17、进一步地，所述稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇中的一种。

18、进一步地，所述水相阻聚剂为亚硝酸钠、硫酸亚铜中的一种或几种。

19、进一步地，所述超声乳化条件为40~80 hz，超声分散10~30分钟。

20、进一步地，所述步骤（2）中所述超声乳化时间为15~30min，第一次溶胀温度为30~50℃，溶胀时间为4~8h；所述步骤（3）中所述第二次溶胀温度为30~50℃，溶胀时间为8~16h；步骤（4）中所述反应温度为60-80℃，反应时间为12-24h。

21、进一步地，所述种子微球为0.5~5质量份；溶胀剂为0.5~5质量份；步骤（2）中十二烷基硫酸钠水溶液50~200质量份；引发剂为0.01~0.3质量份；苯乙烯单体10~50质量份；交联剂单体0.1~5质量份；羧基单体0.5~5质量份；致孔剂10~30质量份；复合染料0.1-1质量份；步骤（3）中十二烷基硫酸钠水溶液10~100质量份。

22、进一步地，溶胀剂优选为为邻苯二甲酸二丁酯、环己烷、氯仿、四氢呋喃中的两种复配，质量比为1:1。

23、进一步地，引发剂优选为过氧化苯甲酰。

24、进一步地，交联剂单体优选为二乙烯基苯。

25、进一步地，羧基单体优选为甲基丙烯酸。

26、进一步地，致孔剂优选为甲苯。

27、进一步地，该荧光微球在制备用于细胞群体中目的细胞群的绝对细胞数量试剂中的应用。

28、进一步地，步骤（1）中所述的种子微球的制备方法，包括如下步骤：

29、a将分散剂加入到反应溶剂中，再加入链转移剂，超声分散成均相体系，加入到反应容器中；

30、b.氮气环境下，对该均相溶液升温，温度为65~80℃，并稳定15~30min后得到稳定体系；

31、c.将引发剂和单体苯乙烯缓慢加入上述反应体系中，以250~600rpm转速进行搅拌，65-80℃条件下反应20~30h；

32、d.将上述反应液分别用无水乙醇和去离子水进行离心、洗涤，将洗涤后产物分散于无水乙醇水溶液中进行梯度沉降分离，超声分散均匀，置于室温重力场分离出非目标尺寸微球，收集沉降后产品保存于微球保存液，获得聚苯乙烯微球。

33、进一步地，所述步骤a.中分散剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和聚乙烯醇中的一种；链转移剂为正十二烷基硫醇、叔十二烷基硫醇、2-丙烯-1-硫醇、苄硫醇、1-丁硫醇等硫醇试剂中的一种；引发剂为偶氮二异庚腈、偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯中的一种。

34、本专利技术的技术方案比现有技术具有以下优点：

35、1、本专利技术提供一种荧光微球的制备方法，通过有机荧光染料彼此的协同效应，不同染料的激发波长和发射波长彼此协同配合，能至少覆盖流式细胞仪的fitc、pe及apc三个检测通道；

36、2、本专利技术制备的荧光微球尺寸均一，球体结构均匀，表面可修饰不同官能团。同时将荧光染料包裹在微球内部，有效减少荧光染料的脱落和泄露，降低荧光淬灭的风险，确保荧光信号的稳定。本专利技术相比于其他工艺更加简单，成本更低，具有较高的稳定性及应用价值。

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【技术保护点】

1.一种荧光微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：所述种子微球为聚苯乙烯微球。

3.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：所述溶胀剂为邻苯二甲酸二丁酯、环己烷、正己烷、四氯甲烷、氯仿、二氯甲烷、甲苯、四氢呋喃中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中所述超声乳化时间为15-30min，第一次溶胀温度为30-50℃，溶胀时间为4-8h；所述步骤（3）中所述第二次溶胀温度为30-50℃，溶胀时间为8-16h；步骤（4）中所述反应温度为60-80℃，溶胀时间为12-24h。

5.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：种子微球为0.5~5质量份；溶胀剂为0.5~5质量份；步骤（2）中十二烷基硫酸钠水溶液50~200质量份；引发剂为0.01~0.3质量份；苯乙烯单体10~50质量份；交联剂单体0.1~5质量份；羧基单体0.5~5质量份；致孔剂10~30质量份；复合染料0.1-1质量份；步骤（3）中十二烷基硫酸钠水溶液10~100质量份。

6.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：所述引发剂为过氧化苯甲 酰、过氧化二碳酸二异丙酯、过氧化二碳酸二环己酯、过氧化二碳酸双(4-叔丁基环己基)酯中的一种；所述交联剂单体为二乙烯基苯、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的一种；所述羧基单体为马来酸酐、丙烯酸、甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯中的一种；所述致孔剂为甲苯、正己烷、环己烷、氯仿中的一种或几种。

7.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：所述稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇中的一种；所述水相阻聚剂为亚硝酸钠、硫酸亚铜中的一种或几种。

8.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：所述染料浓度为0.1~10 mg/mL，滴加加入反应体系中。

9.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：还包括步骤：（5）反应结束后，将产物过筛，除去杂质以及大颗粒，离心洗涤后保存至试剂瓶中。

10.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：该荧光微球在制备用于细胞群体中目的细胞群的绝对细胞数量试剂中的应用。

...

【技术特征摘要】

1.一种荧光微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：所述种子微球为聚苯乙烯微球。

3.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：所述溶胀剂为邻苯二甲酸二丁酯、环己烷、正己烷、四氯甲烷、氯仿、二氯甲烷、甲苯、四氢呋喃中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中所述超声乳化时间为15-30min，第一次溶胀温度为30-50℃，溶胀时间为4-8h；所述步骤（3）中所述第二次溶胀温度为30-50℃，溶胀时间为8-16h；步骤（4）中所述反应温度为60-80℃，溶胀时间为12-24h。

5.根据权利要求1所述的一种荧光微球的制备方法，其特征在于：种子微球为0.5~5质量份；溶胀剂为0.5~5质量份；步骤（2）中十二烷基硫酸钠水溶液50~200质量份；引发剂为0.01~0.3质量份；苯乙烯单体10~50质量份；交联剂单体0.1~5质量份；羧基单体0.5~5质量份；致孔剂10~30质量份；复合染料0.1-1质量份；步骤（3）中十二烷基硫酸钠水...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁中润，黄明阳，韩博文，汪艳涛，
申请(专利权)人：广州市微米生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：

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