用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条及其制备方法，所述诊断试纸条包括设在硬质塑料底板上依次相连的吸水滤纸、固定有抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体（检测区）与兔抗小鼠IgG（质控区）的醋酸纤维膜的检测垫、标记有抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金垫和放置样品的样品垫。本发明专利技术胶体金试纸条用于肉眼检测溶液中的乙酰胆碱酯酶，具有以下优点：①试剂和样本用量极小，样本量可低至10～20μl，因而可以增加标本洗脱液中乙酰胆碱酯酶的浓度，不易出现假阴性结果；②不需贵重仪器，更适于现场应用；③时间大大缩短，提高了检测速度；④试纸条可在室温保存，只需保持试纸条干燥即可。

Colloidal gold chromatography rapid diagnostic test strip for detecting acetylcholinesterase and preparation method thereof

The invention discloses a method for rapid diagnosis strip and preparation method of colloidal gold immunochromatographic assay of acetylcholinesterase, the diagnostic test strip includes a water filter paper, hard plastic plate comprises a fixed anti acetylcholinesterase monoclonal antibody (test) and Rabbit anti mouse IgG (control area) test pad and labeled acetate fiber membrane with colloidal gold pad anti acetylcholinesterase monoclonal antibody and placement of sample sample pad. The invention of colloidal gold strip for acetylcholinesterase in solution by visual inspection, has the following advantages: minimal amount of reagent and sample, the sample size can be as low as 10 ~ 20 L, which can increase the concentration of acetylcholinesterase were eluted, not prone to false negative results; it will not need expensive instruments, more suitable for the site application; the time is greatly shortened, the detection speed is improved; the strip could be stored at room temperature, just keep the strip drying.

【技术实现步骤摘要】
用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条及其制备方法
本专利技术涉及免疫诊断学检测领域，具体涉及用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条及其制备方法。
技术介绍
随着社会工业的发展，周围神经损伤的发病率逐年上升。目前主要的治疗方式为周围神经缝合重建技术。而神经缝合最大的难题在于如何在手术中快速准确鉴别神经干内运动束和感觉束。目前临床上尚缺乏能在短时间内准确鉴别周围神经束性质的方法，一旦发生不同性质神经束的错误吻合必将严重影响术后神经功能的恢复率。因此如何快速准确鉴别周围神经束的性质已成为当今显微外科极其关注的世界难题。免疫层析法(immunochromatography)是一种快速可靠的诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液、血清和溶液)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。目前，采用在免疫传感器反应芯片表面固化胆碱酯酶抗体的方法，利用免疫传感器灵敏度高、快速、准确、特异性强的特点，快速检测溶液中胆碱酯酶的含量。根据运动神经的乙酰胆碱酯酶含量远高于感觉神经的事实，此方法已经成功用于鉴别脊髓的前根和后根(1、SuiT,GeY,LiuW,ZhaoZK,ZhangN,CaoX.Anacetylcholinesteraseantibody-basedquartzcrystalmicrobalancefortherapididentificationofspinalventralanddorsalroots.PLoSOne.2013Jul23；8(7):e69049.2、SuiT,QueJ,KongD,XieH,WangD,ShiK,CaoX,LiX.Rapididentificationofspinalventralanddorsalrootsusingaquartzcrystalmicrobalance.NeuralRegenRes.2013Mar15；8(8):686-92.)本方法的建立为临床快速鉴别诊断周围神经感觉与运动支提供了可能。但是此方案尚存在下列不足，影响其在临床的推广使用：1、芯片稳定性较差：已有方案是首先在晶体金属表面建立一层惰性疏水物质，主要是聚乙烯亚胺和3-氨丙基-三乙氧基硅烷，然后再用戊二醛作为交联试剂乙酰胆碱酯酶抗体结合。戊二醛化学性质较为活泼，一旦被空气氧化，其结合抗体的能力会降低，影响抗原抗体在芯片表面的结合，不但会影响传感器的敏感性，也会使结果随抗体与芯片结合的能力不同而发生改变。芯片的稳定性较差，直接限制其在临床的应用。2、芯片使用的便利性较差：现有方案中，开始检测前首先是将芯片激活，再将戊二醛与芯片结合，再将抗体注射至传感器的反应池中。操作较为繁琐，且抗体需要冷藏或冷冻保存，抗体保存不当也会使其效价降低，传感器的敏感度降低。3、方案中所使用的设备昂贵，每台设备约需人民币50万元，即使简化配置，也需人民币25万元以上。此外此方案操作繁琐，操作人员需要较为熟练的技术。4、干扰因素较多，影响结果的判读。免疫传感器所依据的原理是抗原抗体反应，其特异性取决于抗体的特异性。上述方案所使用的单克隆抗体，其抗原来源于合成多肽，所制备的抗体可以识别乙酰胆碱酯酶的全蛋白，包括人红细胞表面也含有乙酰胆碱酯酶。用于检测的神经断面溶液中乙酰胆碱酯酶的含量极微(1μg/ml左右)，所以手术中的血液污染会影响免疫传感器对胆碱酯酶的读取，不可避免地会影响结果的判断。5、免疫传感器是基于石英震荡天平技术(QCM)，QCM在液态环境中检测得到的芯片的频率变化值(即QCM信号)是由芯片表面质量改变与溶液粘弹性改变共同引起的，数据分析的复杂性显然易见。排除溶液粘弹性因素的影响很困难。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服现有免疫传感器对神经束性质进行判断方法的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种直接用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，用于实时检测神经束的性质。该试纸条可以通过肉眼判断神经束洗脱液中的乙酰胆碱酯酶的含量，从而快速鉴别出周围神经运动束与感觉束，实现运动束对运动束、感觉束对感觉束正确吻合。技术方案：为了解决上述问题，本专利技术的技术方案是提供了一种用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，所述诊断试纸条包括设在硬质塑料底板上依次相连的吸水滤纸、硝酸纤维素膜的检测垫、质控区、检测区、胶体金垫以及样品垫，所述检测垫上的质控区上固定有市售兔抗鼠IgG，检测垫上的检测区固定有抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。其中，上述抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体为小鼠抗乙酰胆碱酯酶抗体。其中，上述质控区喷涂有能与胶体金标记的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体相结合的抗体。其中，上述胶体金垫喷涂有胶体金标记的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。其中，上述胶体金标记的抗胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金直径为20nm～100nm、抗胆碱酯酶单克隆抗体浓度为45μg～100μg/ml。进一步地，作为优选，上述胶体金标记的抗胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金直径为40nm～100nm、抗胆碱酯酶单克隆抗体浓度为64μg～100μg/ml。其中，上述胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体是通过将纯化后的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体与大鼠脑组织进行杂交，进而获取特异性神经源性的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体作为胶体金标记的备选；然后将获取的单克隆抗体分别进行HRP标记，进行两两组合配对检测，确定可夹心检测标准乙酰胆碱酯酶的抗体对作为配对抗体，即得胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。本
技术实现思路
还包括乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：1)免疫原的获得：利用乙酰胆碱酯酶单克隆抗体与大鼠神经组织通过免疫共沉淀法，得到神经组织的乙酰胆碱酯酶蛋白与抗体复合物；2)将乙酰胆碱酯酶蛋白与抗体复合物用甘氨酸溶液解离下来，透析除去甘氨酸得到乙酰胆碱酯酶蛋白，作为免疫原；3)小鼠免疫：挑选六只雌性6周龄的BALB/C小鼠，用免疫原按时间周期进行基础免疫和加强免疫，整个周期为7到10周，第3次加强免疫后根据具体实验要求进行处理或者继续加强免疫；4)融合：在第二次加强免疫7天后和第三次加强免疫7天后分别进行阳性血的采集，进行ELISA检测效价，根据ELISA测定的小鼠血清稀释到1：10000时OD值需达到0.5以上，加强免疫三天后的小鼠，拉颈猝死后，取出脾脏研磨后，按常规方法进行融合，筛选的阳性孔进行多次亚克隆，直至100％阳性，即得到单克隆抗体。本
技术实现思路
还包括用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条的制备方法，包括以下步骤：1)在硬质塑料底板自上而下依次黏贴吸水滤纸、硝酸纤维素膜的检测垫，胶体金垫(吸水玻璃纤维)和样品垫(吸水玻璃纤维)，真空干燥状态下保存，备用。2)按照试纸条组装步骤，分别将抗乙酰胆碱单克隆抗体标记不同直径的胶体金制成胶体金垫，能配对的抗乙酰胆碱单克隆抗体喷点到检测垫的检测区，将兔抗鼠IgG喷点到检测垫的质控区；3)将胶体金垫插入样品垫和检测垫之间，将标准乙酰胆碱酯酶的PBST溶液滴涂到样品垫上，跑样10分钟，根据检测区域现象筛选出可用于检测标准乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，其特征在于，所述诊断试纸条包括设在硬质塑料底板(7)上依次相连的吸水滤纸(1)、检测垫(2)、质控区(5)、检测区(6)、胶体金垫(3)以及样品垫(4)，所述检测垫(2)上的质控区(5)上固定有兔抗鼠IgG，检测垫(2)上的检测区(6)固定有抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，其特征在于，所述诊断试纸条包括设在硬质塑料底板(7)上依次相连的吸水滤纸(1)、检测垫(2)、质控区(5)、检测区(6)、胶体金垫(3)以及样品垫(4)，所述检测垫(2)上的质控区(5)上固定有兔抗鼠IgG，检测垫(2)上的检测区(6)固定有抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，其特征在于，所述抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体为小鼠抗乙酰胆碱酯酶抗体。3.根据权利要求1所述的用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，其特征在于，所述胶体金垫(3)喷涂有胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。4.根据权利要求3所述的用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金直径为20nm～100nm、抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体浓度为45μg～100μg/ml。5.根据权利要求3所述的用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金直径为40nm～100nm、抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体浓度为64μg～100μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：眭涛，戈应滨，曹晓建，唐健，葛大伟，
申请(专利权)人：南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32