一种猕猴桃组织培养方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种猕猴桃组织培养方法及其应用。本发明专利技术所述方法取腋芽在无菌状态下萌发而形成的叶柄作为外植体，诱导愈伤组织的形成，再将所述愈伤组织培育成猕猴桃幼苗，所述培养方法能够降低组织培养过程的污染率，提高愈伤组织的诱导率、发芽率和生根率。另外，本发明专利技术所述应用采用上述方法培植猕猴桃幼苗，所得幼苗具有生长健壮、根系发达和移栽成活率高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种猕猴桃组织培养方法及其应用
本专利技术涉及植物组织培养领域，具体而言，涉及一种猕猴桃组织培养方法及其应用。
技术介绍
猕猴桃(ActinidiaChinensis)是一种经济价值较高的木质藤本植物，其果实肉厚汁多，酸甜适度，营养丰富，以其维生素C特高的营养价值而成为当前水果中之珍品，已经成为当今世界的新兴栽培果树。琼露猕猴桃是中国农业科学院郑州果树研究所1978年从河南省西峡野生资源中选出的优良品系，单果重70～105克，果皮黄褐色，果肉淡黄色，汁多，味酸甜，微香，维生素C含量241～318毫克/100克鲜果肉，可溶性固形物19％，是一个早果、丰产、稳产、抗逆性强、耐土壤高pH值(可耐7.5)、适于密植的中熟加工品种。随着猕猴桃栽培的兴起，猕猴桃良种苗需要量急剧增加。由于猕猴桃是雌雄异株植物，采用播种等常规繁殖方式容易造成品种退化。同时，猕猴桃属雌雄异株，倍性复杂,雌雄株间花期不遇使种间杂交困难，育种周期长，且有不确定性，给育种工作带来了难度，本领域主要采用组织培养的方法对猕猴桃进行快速繁殖。该方法可以保持猕猴桃植株的良种遗传特异性，繁殖速度快，繁殖量大，是现在普遍认同的良种繁育方法。目前，国内外关于猕猴桃组织培养的研究已经比较成熟，但至今尚没有琼露猕猴桃组培再生的研究。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种猕猴桃组织培养方法，所述方法能够降低组培过程中的污染，提高愈伤组织的诱导率、发芽率和生根率。本专利技术的第二目的在于提供一种上述方法在培植猕猴桃幼苗中的应用，所述应用获得的幼苗具有植株生长健壮、根系发达、移栽成活率高的优点。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种猕猴桃组织培养方法，所述方法包括以下步骤：取腋芽在无菌状态下萌发而形成的叶柄作为外植体，接种至诱导培养基，诱导愈伤组织的形成，再将所述愈伤组织培育成猕猴桃幼苗。本专利技术还涉及上述方法在培植猕猴桃幼苗中的应用。本专利技术上述方法能够降低组培过程的污染率、提高愈伤组织的诱导率、发芽率和生根率，获得健壮、成活率高的猕猴桃幼苗。具体实施方式本专利技术涉及一种猕猴桃组织培养方法，所述方法包括以下步骤：取腋芽在无菌状态下萌发而形成的叶柄作为外植体，接种至诱导培养基，诱导愈伤组织的形成，再将所述愈伤组织培育成猕猴桃幼苗。本申请在研究猕猴桃的组培方法时意外地发现，与以叶片或茎段为外植体的组培方法相比，以猕猴桃叶柄作为外植体能够显著提高愈伤组织的诱导率、以及后续不定芽和不定根的发生率，但在组培过程中同时也伴随高比例的污染。经仔细研究发现猕猴桃叶柄表面密布细毛，细菌极易藏身于叶柄的细毛之间，在外植体消毒过程中，消毒液往往只能停留在叶柄表面的细毛上，难以进入叶柄细毛之间的部位，无法彻底消毒，因此，在组培过程中容易引起污染。申请人尝试延长消毒时间以对叶柄进行彻底消毒。该措施在一定程度上能够提升灭菌效果，但由于长时间与消毒剂接触，叶柄的切口处受到消毒剂的严重毒害，切口容易发生褐变甚至致死，抑制愈伤组织的形成。因此，直接消毒猕猴桃的叶柄作为外植体诱导愈伤组织存在污染风险高或外植体容易发生褐变甚至死亡，愈伤组织的诱导成功率低的缺陷。为了克服上述缺陷，本专利技术在组培时巧妙地选取腋芽在无菌状态下萌发而形成的叶柄作为外植体，诱导愈伤组织、不定芽和不定根的形成。由于腋芽是在无菌状态下被诱导萌发，因此由腋芽萌发而形成的叶柄同样也保持高度无菌的状态，故而取该叶柄作为外植体不需要对叶柄进行再次消毒，就能获得远胜于现有技术中使用酒精或升汞对猕猴桃叶柄进行消毒而获得的灭菌效果。同时，由于不需要再次消毒，猕猴桃叶柄的切口因此不会与消毒剂接触，出现褐变或死亡的现象。综上所述，本专利技术上述方法不但能够提高猕猴桃叶柄的无菌程度，还避免消毒剂对叶柄的毒害作用，显著提高外植体形成愈伤组织的诱导率。在一些实施方式中，通过以下方式获得所述叶柄：取灭菌的带腋芽茎段接种到腋芽萌发培养基中进行无菌培养直至腋芽萌发，长出带叶柄的叶片。在一些实施方式中，将所述愈伤组织培育成猕猴桃幼苗具体包括以下步骤：(1)将愈伤组织接种至不定芽再生培养基，诱导不定芽再生；(2)任选的，将不定芽接种至增殖培养基，进行不定芽增殖培养；(3)将不定芽接种至生根培养基，进行生根培养，获得猕猴桃幼苗；(4)任选的，还包括将猕猴桃幼苗进行炼苗移栽的步骤。在一些实施方式中，所述腋芽萌发培养基为包括6-BA、NAA、蔗糖和琼脂的MS培养基。在一些实施方式中，所述腋芽萌发培养基为包括1.0～2.0mg·l-16-BA、0.1～0.5mg·l-1NAA、25～35g·l-1蔗糖和5～10g·l-1琼脂的MS培养基。在一些实施方式中，所述腋芽萌发培养基为包括1.5～2.0mg·l-16-BA、0.1～0.4mg·l-1NAA、25～35g·l-1蔗糖和5～10g·l-1琼脂的MS培养基。在一些实施方式中，所述腋芽萌发培养基为包括1.0～1.5mg·l-16-BA、0.1～0.3mg·l-1NAA、25～35g·l-1蔗糖和5～10g·l-1琼脂的MS培养基。在一些实施方式中，所述腋芽萌发培养基为包括1.0mg·l-16-BA、0.1mg·l-1NAA、30g·l-1蔗糖和7g·l-1琼脂的MS培养基。在一些实施方式中，所述腋芽萌发培养基为包括2.0mg·l-16-BA、0.1mg·l-1NAA、30g·l-1蔗糖和7g·l-1琼脂的MS培养基。在一些实施方式中，所述腋芽萌发培养基为包括2.0mg·l-16-BA、0.5mg·l-1NAA、30g·l-1蔗糖和7g·l-1琼脂的MS培养基。本专利技术上述方法限定6-BA、NAA、蔗糖、琼脂和MS培养基作为诱导腋芽萌发的腋芽萌发培养基的组分，上述组分在功能上互相补充和支持，具有协同增效的作用，能够提升腋芽萌发率。在一些实施方式中，所述诱导培养基为包括ZT、蔗糖和琼脂的MS培养基。在一些实施方式中，所述诱导培养基为包括0.5～1.0mg·l-1ZT、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg·l-1琼脂的MS培养基。在一些实施方式中，所述诱导培养基为包括0.7～1.0mg·l-1ZT、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg·l-1琼脂的MS培养基。在一些实施方式中，所述诱导培养基为包括0.8～1.0mg·l-1ZT、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg·l-1琼脂的MS培养基。在一些实施方式中，所述诱导培养基为包括0.5mg·l-1ZT、30mg·l-1蔗糖、7mg·l-1琼脂的MS培养基。在一些实施方式中，所述诱导培养基为包括0.8mg·l-1ZT、30mg·l-1蔗糖、7mg·l-1琼脂的MS培养基。在一些实施方式中，所述诱导培养基为包括1.0mg·l-1ZT、30mg·l-1蔗糖、7mg·l-1琼脂的MS培养基。本专利技术上述方法对诱导培养基中的植物激素进行优化，从NAA、6-BA、ZT中筛选出ZT加入到诱导培养基，能够提高所述培养基诱导猕猴桃叶柄形成愈伤组织的几率和质量。本专利技术还对ZT的含量进行优化，进一步提高愈伤组织的诱导率和质量。在一些实施方式中，所述不定芽再生培养基的配方与诱导培养基的配方相同。本专利技术出人意料地发现，诱导猕猴桃的叶柄形成愈伤组织后在原诱导培养基中继本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猕猴桃组织培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：取腋芽在无菌状态下萌发而形成的叶柄作为外植体，接种至诱导培养基，诱导愈伤组织的形成，再将所述愈伤组织培育成猕猴桃幼苗。

【技术特征摘要】
1.一种猕猴桃组织培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：取腋芽在无菌状态下萌发而形成的叶柄作为外植体，接种至诱导培养基，诱导愈伤组织的形成，再将所述愈伤组织培育成猕猴桃幼苗。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过以下方式获得所述叶柄：取灭菌的带腋芽茎段接种到腋芽萌发培养基中进行无菌培养直至腋芽萌发，长出带叶柄的叶片。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将所述愈伤组织培育成猕猴桃幼苗具体包括以下步骤：(1)将愈伤组织接种至不定芽再生培养基，诱导不定芽再生；(2)任选的，将不定芽接种至增殖培养基，进行不定芽增殖培养；(3)将不定芽接种至生根培养基，进行生根培养，获得猕猴桃幼苗；(4)任选的，还包括将猕猴桃幼苗进行炼苗移栽的步骤。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述腋芽萌发培养基为包括6-BA、NAA、蔗糖和琼脂的MS培养基；优选地，所述腋芽萌发培养基为包括1.0～2.0mg·l-16-BA、0.1～0.5mg·l-1NAA、25～35g·l-1蔗糖和5～10g·l-1琼脂的MS培养基；进一步优选地，所述腋芽萌发培养基为包括1.0mg·l-16-BA、0.1mg·l-1NAA、30g·l-1蔗糖和7g·l-1琼脂的MS培养基。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基为包括ZT、蔗糖和琼脂的MS培养基；优选地，所述诱导培养基为包括0.5～1.0mg·l-1ZT、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41