一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法技术

一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法，包括种子悬浮液制备、无菌播种和成苗培养等步骤，在成苗培养步骤中将所述黄石斛植株连同成苗培养基转移到具有自然光的温室中炼苗10‑15天，然后洗净根部的成苗培养基，接下来以苔藓为栽培基质进行培养。本发明专利技术采用成熟的蒴果进行无菌播种、两次培养成苗，具有繁殖速度快、种苗品质优良、生长成本低等特点，只需要简单的组织培养设备就可以完成。

【技术实现步骤摘要】
一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法
本专利技术属于植物生物
，特别涉及一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法。
技术介绍
黄石斛（DendrobiumtosaenseMakino）属于兰科石斛属，仅产于我国江西、广东、台湾及日本等地，常被误认为铁皮石斛，在日本和台湾已被作为中药材广泛应用，产量比铁皮石斛产量高，具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力及扩张血管等作用；同时，黄石斛花朵黄绿色，具有较高的观赏价值，可应用于盆栽观赏，具有广阔的应用前景。但由于黄石斛种源稀缺，严重地制约了其产业的发展。目前世界上还没有黄石斛种苗繁殖专利和文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法，包括下列步骤：第一步：将黄石斛蒴果用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水漂洗后切开，将黄石斛种子洗脱至一装有无菌水的容器内制成种子悬浮液；第二步：无菌条件下，将所述种子悬浮液移至装有90-100毫升的含有种子萌发固体培养基的培养容器内进行培养，得到1-2厘米长度的黄石斛苗；其中：所述种子萌发固体培养基为改进MS培养基，在改进MS培养基的基础上添加0.1-0.2毫克/升的萘乙酸、0.5-1.0克/升的活性碳、15-20克/升的蔗糖、6-7克/升的琼脂，所述改进MS培养基还添加有改进MS培养基质量的10-20%的椰子汁；所述改进MS培养基为大量元素减半的MS培养基；所述种子萌发固体培养基的pH值为5.4-5.6；第三步：将所述黄石斛苗接种培养到成苗培养基上进行培养，得到黄石斛植株，每升所述成苗培养基含有花宝1号1-2克、花宝2号1-2克、蛋白胨0.5-2克、土豆泥40-80克、香蕉泥50-100克、活性碳0.5-1.0克、肌醇80-120毫克、甘氨酸1.5~2.5毫克、盐酸硫胺素0.05-0.2毫克、盐酸吡哆醇0.4-0.8毫克、烟酸0.4-0.8毫克、6-苄基腺嘌呤0.5-1.0毫克、萘乙酸0.5-1.0毫克、蔗糖20-30毫克、琼脂6-7毫克，所述成苗培养基的pH值为5.4-5.6；第四步：将所述黄石斛植株连同成苗培养基转移到具有自然光的温室中炼苗10-15天，然后洗净根部的成苗培养基，接下来以苔藓为栽培基质进行培养。优选的技术方案为：将黄石斛蒴果用体积浓度为70-80%的酒精浸泡30-60秒。优选的技术方案为：用质量百分比浓度为0.1-0.2%的升汞溶液消毒10-20分钟。优选的技术方案为：每个所述培养容器内容纳有200-400粒黄石斛种子。优选的技术方案为：在第二步中，培养的条件为：温度24-26℃、光照度1500-2000lx、光照时间为10-12小时/天。优选的技术方案为：在第三步中，培养的条件为：培养温度26-28℃，光照度2000-3000lx，光照时间为12-14小时/天。优选的技术方案为：所述苔藓用水浸泡24-48小时后作为栽培基质。上述技术方案中：所述MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。基于此，这种培养基就用他们的名字来命名了。大量元素是指：NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4。由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有的优点是：本专利技术采用成熟的蒴果进行无菌播种、两次培养成苗，具有繁殖速度快、种苗品质优良、生长成本低等特点，只需要简单的组织培养设备就可以完成。具体实施方式以下对本专利技术之实施方式做更详细的说明，使熟悉该项技艺者在阅读本说明书后能据以实施。本文中使用的术语的目的仅在于说明特别实施例，并不意图对本专利技术做限制。除非上下文明确显示，否则本文中使用的单数形式“一”、“一个”、“该”亦旨在包括复数形式。在说明较佳实施例时，可能基于清楚的目的而使用特别的术语；然而，本说明书所揭露者并不意图被限制在所选择的该特别术语；并且应当理解，每一个特定元件包括具有相同功能、以相似方式操作并达成相似效果的所有等效技术。实施例1：一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法（1）材料：开花时选取生长健壮的黄石斛进行人工授粉，授粉后150天选择种子基本成熟而未开裂的蒴果为外植体用于无菌播种。（2）种子悬浮液制备：将黄石斛蒴果用体积浓度为70%的酒精浸泡30秒后，再用质量百分比浓度为0.1%的升汞溶液中消毒10分钟，无菌水漂洗4次后切开果实，将粉末状基本成熟的种子全部洗脱至一装有200毫升无菌水的三角瓶中，制成种子悬浮液。对每个黄石斛蒴果种子悬浮液进行种子密度的检测，在摇匀情况下用无菌移液枪吸取20微升于生物显微镜下计算其种子数量，每瓶种子悬浮液重复取10次计算其平均每毫升种子数。根据每瓶悬浮液种子浓度用无菌水进一步稀释成种子浓度为60粒/毫升的接种用的种子悬浮液。（3）无菌播种：无菌条件下用移液枪吸取接种用的种子悬浮液5毫升至装有90毫升的含有种子萌发固体培养基的兰花培养瓶中，每瓶黄石斛的种子数量300粒。所述种子萌发固体培养基为改进MS培养基，在改进MS培养基的基础上添加0.1毫克/升的萘乙酸（即每升改进MS培养基添加0.1毫克的萘乙酸）、0.5/升的活性碳、15克/升的蔗糖、6克/升的琼脂，所述改进MS培养基还添加有改进MS培养基质量的10的椰子汁；所述改进MS培养基为大量元素减半的MS培养基；所述种子萌发固体培养基的pH值为5.4.在实验中所采用的培养温度24℃，光照度1500lx，光照10小时/天。种子10天开始萌发，萌发率90%，苗生长均匀统一，90天时苗高1厘米左右。（4）成苗培养：将无菌播种获得的1厘米小苗接种培养到成苗培养基上培养，成苗培养基为花宝1号1克/升，花宝2号1克/升，蛋白胨0.5克/升，土豆泥40克/升，香蕉泥50克/升，活性碳0.5克/升，肌醇80毫克/升，甘氨酸1.5毫克/升，盐酸硫胺素（VB1）0.05毫克/升，盐酸吡哆醇（VB6）0.4毫克/升，烟酸0.4毫克/升，6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.5毫克/升，萘乙酸（NAA）0.50毫克/升，蔗糖20克/升，琼脂7克/升，pH5.4-5.6。60天时能形成高4厘米的健壮的植株，每个植株带2个丛生芽。（5）试管苗移栽：春季和秋季是试管苗出瓶的适宜时期，将具4厘米高完整植株将培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗15天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，采用用水浸泡24小时的进口苔藓为栽培基质，种植时将苔藓的水分拧干，包裹每丛的根系基地种植于穴盘中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90%。实施例2：一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法（1）材料：开花时选取生长健壮的黄石斛进行人工授粉，授粉后160天选择种子基本成熟而未开裂的蒴果为外植体用于无菌播种。（2）种子悬浮液制备：将蒴果用75%的酒精浸泡40秒后0.15％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水漂洗5次后切开果实，将粉末状基本成熟的种子全部洗脱至一装有200毫升无菌水的三角瓶中，制成种子悬本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法，其特征在于：包括下列步骤：第一步：将黄石斛蒴果用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水漂洗后切开，将黄石斛种子洗脱至一装有无菌水的容器内制成种子悬浮液；第二步：无菌条件下，将所述种子悬浮液移至装有90‑100毫升的含有种子萌发固体培养基的培养容器内进行培养，得到1‑2厘米长度的黄石斛苗；其中：所述种子萌发固体培养基为改进MS培养基，在改进MS培养基的基础上添加0.1‑0.2毫克/升的萘乙酸、0.5‑1.0克/升的活性碳、15‑20克/升的蔗糖、6‑7克/升的琼脂，所述改进MS培养基还添加有改进MS培养基质量的10‑20%的椰子汁；所述改进MS培养基为大量元素减半的MS培养基；所述种子萌发固体培养基的pH值为5.4‑5.6；第三步：将所述黄石斛苗接种培养到成苗培养基上进行培养，得到黄石斛植株，每升所述成苗培养基含有花宝1号1‑2克、花宝2号1‑2克、蛋白胨 0.5‑2克、土豆泥 40‑80克、香蕉泥50‑100克、活性碳0.5‑1.0克、肌醇80‑120毫克、甘氨酸1.5~2.5毫克、盐酸硫胺素0.05‑0.2毫克、盐酸吡哆醇0.4‑0.8毫克、烟酸0.4‑0.8毫克、 6‑苄基腺嘌呤0.5‑1.0毫克、萘乙酸0.5‑1.0毫克、蔗糖 20‑30毫克、琼脂6‑7毫克，所述成苗培养基的pH值为5.4‑5.6；第四步：将所述黄石斛植株连同成苗培养基转移到具有自然光的温室中炼苗10‑15 天，然后洗净根部的成苗培养基，接下来以苔藓为栽培基质进行培养。...

【技术特征摘要】
1.一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法，其特征在于：包括下列步骤：第一步：将黄石斛蒴果用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水漂洗后切开，将黄石斛种子洗脱至一装有无菌水的容器内制成种子悬浮液；第二步：无菌条件下，将所述种子悬浮液移至装有90-100毫升的含有种子萌发固体培养基的培养容器内进行培养，得到1-2厘米长度的黄石斛苗；其中：所述种子萌发固体培养基为改进MS培养基，在改进MS培养基的基础上添加0.1-0.2毫克/升的萘乙酸、0.5-1.0克/升的活性碳、15-20克/升的蔗糖、6-7克/升的琼脂，所述改进MS培养基还添加有改进MS培养基质量的10-20%的椰子汁；所述改进MS培养基为大量元素减半的MS培养基；所述种子萌发固体培养基的pH值为5.4-5.6；第三步：将所述黄石斛苗接种培养到成苗培养基上进行培养，得到黄石斛植株，每升所述成苗培养基含有花宝1号1-2克、花宝2号1-2克、蛋白胨0.5-2克、土豆泥40-80克、香蕉泥50-100克、活性碳0.5-1.0克、肌醇80-120毫克、甘氨酸1.5~2.5毫克、盐酸硫胺素0.05-0.2毫克、盐酸吡哆醇0.4-0.8毫克、烟酸0.4-0.8毫克、6-苄基腺嘌呤0.5-1.0毫克、萘乙酸0.5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宋君，史月龙，吴坤林，郑枫，
申请(专利权)人：南京仙草堂生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32