一种铁皮石斛多糖片段及其提取方法技术

本发明专利技术涉及铁皮石斛技术领域，具体涉及一种铁皮石斛多糖片段及其提取方法，该提取方法包括水提、脱蛋白、酶解修饰、纯化、干燥等步骤，提取得到的多糖片段由D‑葡萄糖、D‑甘露糖、D‑半乳糖、L‑鼠李糖、D‑木糖、D‑夫糖六种单糖组成，经实验证明，本发明专利技术的铁皮石斛多糖片段对正常小鼠的胰岛素分泌无刺激作用，安全性更高，而且相对格列吡嗪降糖药，血糖下降率、胰岛素上升率、胰高血糖下降率均比较好，可见本发明专利技术的多糖片段对链脲佐菌素致糖尿病的SD大鼠的降血糖作用显著。

A polysaccharide fragment of Dendrobium officinale and its extraction method

The present invention relates to the technical field of Dendrobium, in particular to a fragment of Dendrobium polysaccharide and its extraction method, the extraction methods including water extraction, deproteinization, enzymatic modification, purification, drying and other steps, the extracted polysaccharide fragment by D D glucose, mannose, galactose, L D. Sugar, xylose, D D husband sugar six monosaccharides, the experiment proved that insulin polysaccharide fragments of the invention of the secretion of normal mice without stimulation, higher safety, and relatively glipizide hypoglycemic drugs, insulin, blood glucose decreased rate of rise, glucagon decreased good, the hypoglycemic effect of SD rat polysaccharide fragment the invention of streptozotocin induced diabetes significantly.

【技术实现步骤摘要】
一种铁皮石斛多糖片段及其提取方法
本专利技术涉及铁皮石斛
，具体涉及一种铁皮石斛多糖片段及其提取方法。
技术介绍
铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo），为兰科多年生附生草本植物。味甘，微寒，归胄、肾经。历代中药典籍《神农本草经》、《本草纲目拾遗》等都有记载，以新鲜或干燥茎入药，具有滋阴清热、养胃生津、补肾益精之功效。传统中医将具有多饮，多食，多尿，久则身体消瘦或尿有甜味为主要症状的一类病症，称为“消渴”，而消渴症包括糖尿病。消渴症的发生以肾阴虚，肺胃燥热为基本病机，以气阴两虚为其病理特点。早在《黄帝内经》中提出治法以“养阴生津，平衡阴阳”为主。《本草正》云：石斛“能退火，养阴，除烦……亦止消渴热汗”。《中药大辞典》记载石斛“清热养阴，用于热病伤津，口干烦渴”。石斛既能生津止渴，又能清肺胃虚热，自古以来就是治疗消渴症的专药。目前针对铁皮石斛降血糖功效的研究实验均存在多糖提取率低、杂质含量高、多糖成分不明确、作用特定性不强等缺点，且提取方法较为传统、单一，得到的多糖品质较差，对降血糖作用存在非特效型。《霍山石斛多糖及其酶解片段抑制H2O2诱导人晶状体上皮细胞凋亡的研究，李小龙，合肥工业大学硕士学位论文》的作者从霍山石斛类原球茎中提取了命名为DHPD1的多糖片段，并最终得出了DHPD1及其酶解片段可以显著抑制H2O2诱导人晶状体上皮（HLE细胞）损伤和凋亡的结论，但是其并未研究该多糖片段调节血糖的效果。本专利技术人依照论文所述地方法重新提取了DHPD1，发现虽然DHPD1确实能够缓解链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病型白内障，但是降血糖的功效并不明显。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种对链脲佐菌素致糖尿病的SD大鼠的降血糖作用显著的铁皮石斛多糖片段。本专利技术的另一目的在于提供一种铁皮石斛多糖片段的提取方法，该提取方法提取率高、除杂率高。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种铁皮石斛多糖片段，由如下摩尔百分比的单糖组成：D-葡萄糖11.4%-21.8%D-甘露糖24.0%-36.5%D-半乳糖8.3%-19.0%L-鼠李糖13.2%-19.0%D-木糖3.8%-8.6%D-夫糖7.7%-13.3%，其中，所述铁皮石斛多糖片段的分子量为3074.8-3192.6。本专利技术的多糖片段从铁皮石斛中提取而得，经实验证明，本专利技术的铁皮石斛多糖片段对正常小鼠的胰岛素分泌无刺激作用，安全性更高，而且相对格列吡嗪降糖药以及DHPD1，血糖下降率、胰岛素上升率、胰高血糖下降率均比较好，可见本专利技术的多糖片段对链脲佐菌素致糖尿病的SD大鼠的降血糖作用显著。优选地，所述铁皮石斛多糖片段由如下摩尔百分比的单糖组成：D-葡萄糖11.4%-15.2%D-甘露糖26.0%-31.5%D-半乳糖9.4%-12.0%L-鼠李糖15.2%-19.0%D-木糖3.8%-4.6%D-夫糖8.3%-9.3%。本专利技术的另一专利技术目的通过下述技术方案实现：一种铁皮石斛多糖片段的提取方法，包括如下步骤：（1）水提：将铁皮石斛用水提取，得到铁皮石斛水提取液；（2）脱蛋白：利用脱蛋白方法对铁皮石斛水提取液进行脱蛋白处理，得到粗提取液；（3）酶解修饰：对所述粗提取液进行加入生物酶剂进行酶解，得到混合多糖提取液，所述生物酶剂包括纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶中的至少一种；（4）纯化：利用纯化方法对混合多糖提取液进行纯化处理，去除小分子杂质，得到单一多糖提取液，所述小分子杂质包括无机盐、低聚糖；（5）干燥：将单一多糖提取液进行干燥，即得到所述的铁皮石斛多糖片段。通过本专利技术的提取方法，可以从铁皮石斛中提取本专利技术的均一的多糖片段，步骤简单，除杂率高、提取率在1.2%以上（提取率=多糖片段重量/铁皮石斛原料重量）。其中，所述步骤（1）水提具体步骤为：将铁皮石斛粉碎至60目以上，超声水浸提取1-3次，每次提取所用的水为铁皮石斛的20-30重量倍，然后取滤液进行减压浓缩，得到所述的铁皮石斛水提取液。其中超声的频率为30-50kHz，每次水浸提取的时间为10-30min。本专利技术的步骤（1）水提的主要创新点在于运用了超声技术，通过振动能量切断多糖分子的部分糖苷键，从而降低多糖分子量、促进多糖水溶性，进而提高本专利技术铁皮石斛多糖片段的生物活性，降血糖的效果响应时间有所降低。其中，所述步骤（2）脱蛋白的具体步骤为：往所述的铁皮石斛水提取液加入90%-95%的乙醇，使多糖沉淀（一般使铁皮石斛水提取液中的乙醇体积分数为80%-90%即可），收集沉淀物，将沉淀物溶解于水中，加入Sevage试剂，混合均匀后离心，取上清液，即得到所述粗提取液。本专利技术的步骤（2）脱蛋白的具体步骤首先利用醇沉提取出粗糖沉淀物，除去水溶性而不溶于乙醇的杂质，将粗糖沉淀物重新溶于水后，再进一步地利用Sevage试剂将蛋白质沉淀出来，通过离心取得上清液。通过本专利技术的步骤（2），已经将大部分的大分子蛋白质去除。优选地，所述Sevage试剂由氯仿和正丁醇按体积比5:1的比例混合组成，所述Sevage试剂与溶解了粗糖沉淀物的水的体积比为1:2，并且在加入Sevage试剂后，摇晃溶液0.3-0.7h，然后再以900-1100r/min的速度进行离心，最后取得上清液。通过更为优选地方法取得的上清液相对更纯净。其中，所述步骤（3）酶解修饰控制酶解的温度为48-50℃，酶解的pH值为4.5-5.2，酶解的反应时间为70-110min，所述生物酶剂由纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶溶于溶剂中制得，所述生物酶剂中纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的质量浓度分别为0.5%-0.9%、0.3%-0.7%、1.1%-1.5%。本专利技术的核心技术点之一在于采用纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶组合的生物酶剂对多糖片段进行修饰，利用纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的特异性对多糖片段的特定糖苷键进行降解，使新生成的非还原末端行程末端，从而改变了多糖片段的单糖组成以及聚合结构，决定了本专利技术铁皮石斛多糖片段在降血糖作用上的显著性。也因此，对于纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的用量选择是有很大地讲究的，不同地用量比例会影响不同糖苷键的降解程度不同，从而可能形成结构、功能完全不一样的多糖片段。本专利技术人通过对酶解温度、酶解pH、酶解时间以及生物酶剂中酶的种类和用量进行多次重新组合，然后以实践得出结论，最终得出了得出了上述的优选方案。在众多的优选方案中，更为优选地，所述生物酶剂中纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的质量浓度分别为0.7%、0.5%、1.3%。其中，所述步骤（4）纯化包括如下步骤：A、超临界萃取：萃取温度为40-60℃，萃取压力为180-220bar，二氧化碳流量为15-25L/h，萃取时间为90-150min，每隔20-40min收集一次萃取产物；B、凝胶柱层析：取所述萃取产物，上SephadexG-75凝胶柱，用0.5-1.5mol/L的Tris-HCl缓冲液以1-3ml/min的流速进行洗脱，以硫酸-苯酚法检测，得纯化液；C、透析：将纯化液在0-8℃的温度下透析10-14h，得到所述单一多糖提取液。通过上述步骤（4）纯化的具体操作，进一步出去了多糖片段中小数难以除去的小分子杂质。虽然本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铁皮石斛多糖片段，其特征在于：由如下摩尔百分比的单糖组成：D‑葡萄糖                      11.4%‑21.8%D‑甘露糖                      24.0%‑36.5%D‑半乳糖                      8.3%‑19.0%L‑鼠李糖                      13.2%‑19.0%D‑木糖                        3.8%‑8.6%D‑夫糖                        7.7%‑13.3%，其中，所述铁皮石斛多糖片段的分子量为3074.8‑3192.6。

【技术特征摘要】
1.一种铁皮石斛多糖片段，其特征在于：由如下摩尔百分比的单糖组成：D-葡萄糖11.4%-21.8%D-甘露糖24.0%-36.5%D-半乳糖8.3%-19.0%L-鼠李糖13.2%-19.0%D-木糖3.8%-8.6%D-夫糖7.7%-13.3%，其中，所述铁皮石斛多糖片段的分子量为3074.8-3192.6。2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛多糖片段，其特征在于：由如下摩尔百分比的单糖组成：D-葡萄糖13.4%-17.9%D-甘露糖29.0%-33.5%D-半乳糖10.4%-14.9%L-鼠李糖15.2%-19.0%D-木糖3.8%-7.6%D-夫糖8.3%-12.3%。3.如权利要求1或2所述的一种铁皮石斛多糖片段的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）水提：将铁皮石斛用水提取，得到铁皮石斛水提取液；（2）脱蛋白：对铁皮石斛水提取液进行脱蛋白处理，得到粗提取液；（3）酶解修饰：对所述粗提取液加入生物酶剂进行酶解，得到混合多糖提取液，所述生物酶剂包括纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶中的至少一种；（4）纯化：对混合多糖提取液进行纯化处理，去除小分子杂质，得到单一多糖提取液；（5）干燥：将单一多糖提取液进行干燥，即得到所述的铁皮石斛多糖片段。4.根据权利要求3所述的一种铁皮石斛多糖片段的提取方法，其特征在于：所述步骤（1）中，水提的具体步骤为：将铁皮石斛粉碎至60目以上，超声水浸提取1-3次，每次提取所用的水为铁皮石斛的20-30倍重量，然后取滤液进行减压浓缩，得到所述的铁皮石斛水提取液。5.根据权利要求3所述的一种铁皮石斛多糖片段的提取方法，其特征在于：所述步骤（2）中，脱蛋白的具体步骤为：往所述的铁皮石斛水提取液加入质量分数为90%-95%的乙醇，使多糖沉淀，收集沉淀物，将沉淀物溶解于水中，加入Sevage试剂，混合均匀后离心，取上清液，即得到所述粗提取液。6.根据权利要求3所述的一种铁皮石斛多糖片段的提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡平平，卢续贞，
申请(专利权)人：广东国方医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44