一种纸基灵敏检测miRNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种纸基灵敏检测miRNA的方法，更确切的说采用特异性双链核酸酶在纸芯片上构建了miRNA的信号放大机制，通过固定在纸芯片上的纳米金电极上的金与亚甲基蓝标签标记巯基修饰的DNA发夹探针SH‑CP‑21上的巯基形成金‑硫键，将此发夹探针自组装在纸芯片上，并用巯基乙醇有在纸芯片上表面阻挡此发夹探针，随后由于目标miRNA和固定在纸芯片上的发夹探针之间的杂交导致RNA / DNA双链体的形成，并且双链特异性核酸酶会切割RNA / DNA双链体中标记的发夹探针，切割后带有标记发夹探针又会与目标miRNA杂交导致RNA / DNA双链体的形成，照此循环，由于标记的发夹探针被切割，再用电化学方法检测的电流与没切割之前检测的电流有很大差距，从而提高检测的灵敏度，降低检测成本。

Method for sensitive detection of miRNA based on paper base

The invention discloses a method for sensitive detection of paper based miRNA, more specifically in the paper is constructed on the miRNA chip signal amplification mechanism with specific double stranded nucleic acid enzyme, the formation of disulfide bonds by gold and gold methylene blue labeled thiol modified gold nanoparticles electrode fixed on the paper on the chip DNA. SH CP hairpin probe 21 thiol, the hairpin probe self-assembled in the paper on the chip, and with mercaptoethanol in this paper on the chip surface barrier hairpin probe, then due to the hybridization between target miRNA and fixed on the paper on the chip of the hairpin probe led to RNA / DNA duplexes formed and, the duplex specific nuclease cut RNA hairpin probe / tag double stranded DNA in the body, after cutting the labeled hairpin probe will lead to hybridization with target miRNA / RNA formation DNA duplexes, according to this cycle, as markers The hairpin probe is cut, and the current detected by electrochemical method has a great gap with the current detected before cutting. Thus, the sensitivity of detection and the detection cost are improved.

【技术实现步骤摘要】
一种纸基灵敏检测miRNA的方法
本专利公开了一种纸基灵敏检测miRNA的方法，涉及手绘纸电极方法和手动制作纸金电极方法和电化学检测
，即在一张纸上利用蜡笔和铅笔通过手绘技术制作手绘纸电极再通过化学生长法，生长金纳米金，制作纸芯片，更确切的说采用特异性双链核酸酶（duplexspecificnuclease，DSN）在纸芯片上构建了miRNA的信号放大机制，即目标miRNA与亚甲基蓝标签标记巯基修饰的DNA发夹探针SH-CP-21在纸芯片上形成DNA/RNA的杂交核酸双链，随后DSN切割RNA/DNA双链体的氧化还原标记的发夹探针，切割后带有标记发夹探针又会与目标miRNA杂交导致RNA/DNA双链体的形成，照此循环，再通过电化学方法检测。
技术介绍
随着现在生活节奏的加快，不健康的饮食和无规律的作息时间等一系列坏习惯导致了人类患上了不同的疾病。癌症已经成为威胁人类健康的一大杀手，近年来其发病率及死亡率更是呈现逐步走高的趋势。研究发现，miRNA与癌症密切相关，可以作为癌症早期的检测标志物。它广泛存在于各种体液里，包括唾液、血浆、精液、眼泪和尿液等。而且癌症的发生与多种miRN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纸基灵敏检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤：（1）制备所需要的试剂焦炭酸二乙酯处理水成分是1 L 无菌水、1000 µL 焦炭酸二乙酯，经摇床过夜、次日高温高压灭菌30 min 得到；生长溶液是由667 µL 质量分数为1% 的氯金酸、1000 µL 焦炭酸二乙酯处理水、0.0139 g 盐酸羟胺组成；400 mL 探针DNA缓冲溶液成分是1.0412 g 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、24.5 g 高氯酸钠，经焦炭酸二乙酯处理水稀释，浓盐酸调节PH到7得到；（2）纳米金修饰纸芯片将纳米金溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次，将生长溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干...

【技术特征摘要】
1.一种纸基灵敏检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤：（1）制备所需要的试剂焦炭酸二乙酯处理水成分是1L无菌水、1000µL焦炭酸二乙酯，经摇床过夜、次日高温高压灭菌30min得到；生长溶液是由667µL质量分数为1%的氯金酸、1000µL焦炭酸二乙酯处理水、0.0139g盐酸羟胺组成；400mL探针DNA缓冲溶液成分是1.0412g4-羟乙基哌嗪乙磺酸、24.5g高氯酸钠，经焦炭酸二乙酯处理水稀释，浓盐酸调节PH到7得到；（2）纳米金修饰纸芯片将纳米金溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次，将生长溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次；（3）巯基和纳米金形成金-硫键纸芯片上滴加5µL10nM用亚甲基蓝标签标记巯基修饰的DNA发夹探针SH-CP-21，在黑暗环境下室温放置2h，然后用20µL一倍的磷酸盐缓冲盐水洗，自然晾干；（4）巯基乙醇的表面阻挡纸芯片上滴加8µL巯基己醇自然晾干，最后...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘海云，杨浩，何涛，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37