一种指示Nrf2‑Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统技术方案

本发明专利技术公开了一种指示Nrf2‑Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统，提供了与eGFP N端158位氨基酸融合的Nrf2蛋白和与eGFP C端159位氨基酸融合的Keap1蛋白编码基因重组的表达载体，同时转染细胞后，表达的Nrf2与Keap1相互作用，融合的荧光蛋白eGFP的N端和C端重构成完整荧光蛋白。本发明专利技术将BIFC系统瞬时转染细胞或构建成稳定表达细胞系，可观察到细胞核中形成的特异信号，该信号可以特异显示并反映活细胞中Nrf2‑Keap1信号通路活性状态及其变化，为通过检测BiFC荧光变化筛选影响Nrf2‑Keap1相互作用的小分子化合物及抗肿瘤药物奠定基础。

A method and a system for detecting Nrf2 indicating the interaction of Keap1 in BiFC cells

The invention discloses a method and a system for detecting Nrf2 indicating the interaction of Keap1 in BiFC cells, provides 158 amino acid fusion protein Nrf2 and eGFP N terminal and Keap1 protein gene encoding 159 amino acid fusion with eGFP C terminal expression vector and transfected cells, the expression of interaction Nrf2 and Keap1, the fusion of fluorescent protein eGFP N and C terminal form complete fluorescent protein. The invention of the BIFC system or transiently transfected cells constructed stable expression cell lines can be observed in the nucleus of the formation of specific signal, the signal can be displayed and reflected specific Nrf2 Keap1 signaling pathway activity state and change of cells, and lay the foundation for small molecules by detecting the fluorescence of BiFC Nrf2 Keap1 interaction screening effect and anti tumor drugs.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统。
技术介绍
化学药物治疗是肿瘤治疗技术的常规疗法，但化疗耐药性仍是目前肿瘤临床治疗的难点，会导致肿瘤复发、转移，严重影响患者生存质量。Nuclearfactorerythroid2-relatedfactor(Nrf2)可调控抗氧化反应，抵抗由活性氧和亲电试剂造成的细胞损伤。Kelch-likeECHassociatedprotein1(Keap1)，是依赖于(Cullin-3)的E3连接酶复合物的特异性底物衔接蛋白，负调控Nrf2的活性。肿瘤细胞Keap1-Nrf2通路常处于过度激活状态，Nrf2表达上调，以抵抗胞内高水平的ROS和化疗药物的攻击，但是肿瘤细胞产生耐药性的机理十分复杂，Keap1与Nrf2的调控作用模型还存在争议，肿瘤细胞耐药性与Keap1/Nrf2通路的分子调控机理还有待于进一步研究。人体细胞电子失衡与多种疾病发生相关，如果体内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)水平升高，就会使得氧化还原状态失衡。Nrf2与Keap1及其下游靶基因的抗氧化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种指示Nrf2‑Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，由若干融合蛋白组合构成，所述融合蛋白包括融合有Nrf2和eGFP缺失C末端的N158蛋白、融合有Keap1和eGFP缺失N末端的C159蛋白对应的编码基因片段以及表达载体pEGFP‑C1删掉编码GFP的编码片段重组构成的表达载体，所述Nrf2和N158之间以及Keap1和C159之间由linker多肽组成；所述融合蛋白组合：A.Nrf2+linker+N158；B.N158+linker+Nrf2；C.Keap1+linker+C159；D.C159+linker+Keap1；BiFC检测时可以任意将AC、AD、BC、B...

【技术特征摘要】
1.一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，由若干融合蛋白组合构成，所述融合蛋白包括融合有Nrf2和eGFP缺失C末端的N158蛋白、融合有Keap1和eGFP缺失N末端的C159蛋白对应的编码基因片段以及表达载体pEGFP-C1删掉编码GFP的编码片段重组构成的表达载体，所述Nrf2和N158之间以及Keap1和C159之间由linker多肽组成；所述融合蛋白组合：A.Nrf2+linker+N158；B.N158+linker+Nrf2；C.Keap1+linker+C159；D.C159+linker+Keap1；BiFC检测时可以任意将AC、AD、BC、BD其中的一个组合同时转染细胞，进行荧光显微检测，这4种组合条件下均可检测到Nrf2-Keap1在细胞中的相互作用；所述的Nrf2和Keap1为完整的氨基酸序列，所述eGFP的N158为对应氨基酸残基自N末端第1-159位氨基酸；所述eGFP的C159为对应氨基酸残基自N末端第159-265位氨基酸，所述的linker的长度为5个氨基酸RSIAT；所述Nrf2蛋白的DNA序列如SEQIDNO：1所示；所述Keap1蛋白的DNA序列如SEQIDNO：2所示；所述Keap1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示所述eGFP蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示；所述RSIATLinker蛋白的DNA序列如SEQIDNO：6所示。2.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述的重组而成的载体由表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：周波，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23