本发明专利技术提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒。本发明专利技术提供的探针包括发卡探针和环形探针，发卡探针依次包括5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3），5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3）均为单链核苷酸，其中，5’端侧链（1）和环区（2）具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，5’端侧链（1）和3’端侧链（3）的部分核苷酸序列互补，3’端侧链（3）具有与环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列；本发明专利技术提供的miRNA检测方法，能区分待测miRNA、与靶标序列相似的miRNA、及目标miRNA前体；且检测血液样品时不需要miRNA抽提和纯化。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒。本专利技术提供的探针包括发卡探针和环形探针，发卡探针依次包括5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3），5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3）均为单链核苷酸，其中，5’端侧链（1）和环区（2）具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，5’端侧链（1）和3’端侧链（3）的部分核苷酸序列互补，3’端侧链（3）具有与环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列；本专利技术提供的miRNA检测方法，能区分待测miRNA、与靶标序列相似的miRNA、及目标miRNA前体；且检测血液样品时不需要miRNA抽提和纯化。【专利说明】—种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒
本专利技术涉及核酸分子检测领域，具体涉及一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒。
技术介绍
miRNA是真核生物细胞中一类非编码小分子RNA，主要在转录后水平发挥调控靶基因的作用。miRNA参与调节众多生理病理过程，特别在肿瘤的发生和发展中发挥着重要的调节作用。伴随着癌症的发生发展，miRNA水平在外周体液(特别是血清)中的异常波动成为癌症早期诊断的重要生理指标。然而，miRNA通常尺寸小，在体液中的丰度低，且同一家族内不同miRNA的核酸序列高度相似，因而实现miRNA的高灵敏分析具有很大的挑战性。目前，qRT-PCR(定量逆转录聚合酶链式反应)、miRNA微阵列和第二代测序技术是主要的miRNA检测手段。其中，miRNA微阵列和第二代测序技术在高通量检测和挖掘新的miRNA上较有优势，但是检测的特异性和灵敏度有待提高；此外，目前微阵列和第二代测序技术需要专业且昂贵的设备进行数据采集和数据解析，从而限制了它们的广泛应用；qRT-PCR是目前最为认可的miRNA定量检测手段，具有较高的检测特异性和灵敏度，但是该方法需要额外的反转录反应，并且引物设计的难度较高，操作过程较为繁琐。滚环扩增是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法，以单链环状DNA为模板，以寡聚核苷酸为引物(与部分环状模板互补)，在有顶替作用的DNA聚合酶作用下，引物延伸一个循环至起始延伸处再顶替剥离下旧的DNA链而进行下一轮扩增，如此循环，生成包含若干重复序列的DNA长链。基于滚环扩增的miRNA检测通常需要高温孵育(55°C~65°C )促进锁式探针和miRNA间的退火，然而处理的温度接近或高于发卡结构的miRNA前体的熔解温度，miRNA前体本身包含miRNA序列，因此会形成miRNA前体与锁式探针之间的错配，从而影响检测的特异性。针对上述问题，有必要提供一种不仅能特异性的区分待测miRNA、与待测miRNA相似的序列、及目标miRNA的前体，而且简单易行，能快速、高灵敏对检测样品中miRNA浓度的方法。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术第一方面提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针。本专利技术第二方面提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测方法。本专利技术第三方面提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测试剂盒。本专利技术提供的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒在生物医学研究和疾病早期诊断方面具有广阔的应用价值，不仅能特异性的区分待测miRNA、与待测miRNA相似的序列、及目标miRNA的前体，而且简单易行，能快速、高灵敏检测样品中miRNA的浓度。本专利技术所述“miRNA”是指微小核糖核酸。第一方面，本专利技术提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，包括发卡探针和环形探针，所述发卡探针依次包括5’端侧链(I)、环区(2)以及3’端侧链(3)，所述5’端侧链(I)、环区(2)以及3’端侧链(3)均为单链核苷酸，其中，所述5’端侧链(I)和环区(2)具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，所述5’端侧链(I)和3’端侧链(3)的部分核苷酸序列互补，所述3’端侧链(3)具有与所述环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。优选地，所述发卡探针的3’端侧链(3)依次包括与5’端侧链(I)互补的核苷酸序列(31)以及与5’端侧链(I)不互补的核苷酸序列(32)，所述核苷酸序列(32)与所述环形探针的部分核苷酸序列互补时形成双链核苷酸(4)，所述双链核苷酸(4)的解链温度为5~15。。。进一步优选地，所述发卡探针具有茎-环二级结构的初始状态，由茎部和环部构成，茎部由双链核苷酸(5)和核苷酸序列(32)组成，环部为环区(2)，其中，所述双链核苷酸(5)为所述5’端侧链(I)与核苷酸序列(31)互补形成，当待测miRNA不存在时，所述发卡探针以初始状态存在；当待测miRNA存在时，所述待测miRNA与发卡探针的5’端侧链(I)及环区(2)互补形成双链核苷酸(6 )，所述双链核苷酸(5 )解体，随后所述环形探针结合发卡探针的3 ’端侦 ( 3)，得到miRNA-发卡探针-环形探针复合物，其中，所述发卡探针的3’端侧链(3)与环形探针结合的互补区为双链核苷酸(7)。本专利技术所述核苷酸链之间互补形成双链核苷酸为两条具有互补核苷酸序列的单链核苷酸通过其互补碱基之间的氢键作用形成双链。在滚环扩增反应体系中，所述环形探针很难竞争性结合初始状态发卡探针的3 ’端侧链(3)，只有当目标miRNA与发`卡探针互补配对后，探针的发卡结构被完全打开，暴露出与环形探针互补的区域，即发卡探针由初始状态转为成为解链状态时，环形探针极易结合到发卡探针的3’端侧链(3);形成miRNA-发卡探针-环形探针复合物后，发卡探针作为引物、环形探针作为模板，在Phi29DNA聚合酶的参与下实现滚环扩增。进一步优选地，所述初始状态发卡探针的双链核苷酸(5)的解链温度为45~650C;所述miRNA-发卡探针-环形探针复合中，所述双链核苷酸(7)的GC含量为40~60%，解链温度为45~65°C。发卡探针的设计是本专利技术提供的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法的关键所在，设计所述发卡探针时有两个原则如下:1、发卡探针茎干的5’端侧链(I)和环区(2)同目标miRNA的碱基完全互补；2、发卡探针茎干的发卡结构(与5’端侧链(I)互补形成)区域(31)和3’端侧链的突出区域(32)同环形探针的部分碱基完全互补；本专利技术提供的发卡探针和环形探针的具体设计原则如下:I)、整个发卡探针的熔解温度范围为45~65°C，以确保其在扩增反应条件下能稳定存在;2)、传统的发卡探针的5’端侧链和3’端侧链完全互补，而本专利技术提供的发卡探针在其3’端添加一小段序列(32)，该小段序列(32)可以调节发卡探针与环形探针配对区域的GC含量在40%~60%，并确保发卡探针与环形探针配对时退火温度范围为45~65°C，以确保其在扩增反应条件下能稳定存在；此外，所添加的小段序列(32)单独与环形探针配对时退火温度范围为5~15°C，以确保其在滚环扩增反应条件下不能单独与环形探针结合；当目标miRNA与发卡探针互补配对后，探针茎干的发卡结构被完全打开，暴露出与环形探针互补的区域，且在扩增反应条件下，因为环形探针和发卡探针配对的退火温度范围为45~65°C，所以该配对能稳定存在，从而发卡探针可以作为引物在Phi29DNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，包括发卡探针和环形探针，所述发卡探针依次包括5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3），所述5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3）均为单链核苷酸，其中，所述5’端侧链（1）和环区（2）具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，所述5’端侧链（1）和3’端侧链（3）的部分核苷酸序列互补，所述3’端侧链（3）具有与所述环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，李莹，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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