微载体悬浮培养细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法技术

本发明专利技术涉及用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其包括以下步骤：将BHK21细胞复苏，采用低血清培养基进行微载体培养，然后以细胞维持液替换低血清培养基，进行灌流连续培养，使细胞密度维持在1.5～3×10

Method for producing pseudorabies virus gE gene deletion virus vaccine by microcarrier suspension culture cell

The invention relates to a method for producing BHK cells of porcine pseudorabies virus gE gene deletion vaccine, which comprises the following steps: BHK21 cells, the medium of microcarrier culture with low serum, then the cells to maintain the liquid to replace the low serum medium, with continued linger culture, which the cell density remained at 1.5 ~ 3 x 10

【技术实现步骤摘要】
微载体悬浮培养细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法。
技术介绍
猪伪狂犬病病毒(PRV)属于疱疹病毒科a疱疹病毒亚科水泡病毒属猪疱疹病毒I型，猪是该病毒的唯一自然宿主，引起猪的伪狂犬病。该病在猪群多呈暴发流行，主要危害母猪群，引起母猪流产或垂直传播给仔猪，造成初生仔猪大量死亡，给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。目前尚无治疗猪伪狂犬病的有效药物，因此疫苗接种成为控制该病发生和流行的主要措施。目前在市场上广泛使用是自然缺失弱毒疫苗。自然缺失弱毒疫苗是通过非猪源细胞或鸡胚的连续传代，或在某些诱变剂的存在下，用低于或高于通常的培养温度在细胞培养物上连续传代获得，其基因组的内部存在着多处的点突变以及一些基因的缺失，它是一种自然的基因缺失疫苗。其中，世界上使用最广泛的疫苗主要是PRVBartha-K61株疫苗，然而近几年我国猪伪狂犬疫病流行现状表明使用的PRVBartha-K61株疫苗免疫猪产生的中和抗体不能有效中和新分离的病毒PRVHeN1株，该疫苗不能完全保护新流行PRV的攻击。伪狂犬病基因缺失疫苗是利用基因工程技术在PRV基因组中插入或缺失一段序列，致使PRV的某些基因(特别是一些毒力基因)不能表达，从而使PRV的毒力减弱，同时又保持其较强的免疫原性。伪狂犬病糖蛋白基因gE是造成伪狂犬病毒潜伏和免疫逃避的主要因素，是伪狂犬病毒的主要毒力相关基因。糖蛋白gE是至今发现的所有PRV毒株(某些疫苗株除外)均能表达的蛋白，具有群特异性，在PRV的鉴别诊断中具有重要的意义。因此，通过接种伪狂犬病毒gE基因缺失灭活疫苗来预防和控制狂犬病，已成为国际上普遍接受和流行的方法。目前对猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗的研究主要是针对如何构建和筛选伪狂犬病病毒基因缺失的毒株，而对相应毒株的扩大培养条件没有进行深入的研究，大部分是采用常规的培养条件，如公开号为CN1244692C的中国专利申请“一种伪狂犬病TK-/gE-/gI-基因缺失标志活疫苗及制备方法”，将构建的基因缺失伪狂犬病病毒株采用原代鸡胚成纤维细胞进行转瓶培养，不仅不易转染，易引入污染，且规模较小，不适合疫苗的大规模生产。微载体反应器培养是贴壁细胞进行大规模培养的常用手段，兼有悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易，在微球表面培养细胞可以在较短时间内得到大量的细胞，且细胞传代只需要添加新的微载体，基本上可避免细胞在胰酶消化过程中受到的损伤，因此微载体培养细胞技术是非常方便和有意义的。目前，我国应用于细胞培养生产病毒疫苗的商品化微载体主要有：GE公司的CytodexⅠ、CytodexⅡ、CytodexⅢ和Thermo公司的Cytopore、Cytoline、Biosilon、CultispherG等，价格昂贵，导致病毒疫苗生产的成本大大增加。因此，有必要提供一种成本较低，且可大规模生产高病毒滴度的猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，以充分实现猪伪狂犬gE基因缺失病毒低毒，免疫原性强的价值。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法。本专利技术提供的技术方案为如下：一种微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其包括以下步骤：(1)将种子细胞BHK21进行复苏，然后接种至搅拌式生物反应器中，采用低血清培养基进行微载体悬浮培养，培养条件为：转速30～50r/min，溶氧40～60％、pH值7.2～7.3、温度36.5～37.5℃，培养至细胞的浓度为1.5～3×107个/ml；(2)沉降微载体和细胞，以细胞维持液替换低血清培养基，进行灌流连续培养，培养条件为：转速60～80r/min，溶氧30～50％、pH值7.4～7.5、温度35～37℃，灌流速度为1～2个反应器体积/天，同时以同样的速率泵出细胞悬浮液，保证细胞在反应器中停留时间内扩增至1.5～3×107个/ml；(3)将猪伪狂犬gE基因缺失病毒按照感染复数为0.01，接种至连续培养的BHK21细胞反应器中进行培养，培养条件为：转速40～50r/min，溶氧40～50％、pH值7.4～7.5、温度35.5～36.5℃，接毒12h后开始灌流，灌流速度为1个反应器体积/天，接毒48h后开始收获病毒液；(4)将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，即得。其中，上述的将种子细胞BHK21进行复苏具体为：将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6～8min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为3～5×105个/mL的细胞悬液。进一步地，所述的低血清培养基的组成为包含有1～1.5％(m/v)FBS、0.5～2％(m/v)D-氨基葡萄糖、2～4mmol/L谷氨酰胺、4～6％(m/v)生长促进剂、1.0～1.2％(v/v)双抗的DMEM培养液。所述的细胞维持液的组成为包含有4～8mmol/L谷氨酰胺、0.4～1.2mg/L二亚油酰磷脂胆碱、2～6％(m/v)D-氨基葡萄糖、2～4％(m/v)生长促进剂、1.0～1.2％(v/v)双抗的DMEM培养液。进一步地，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.05～0.2的质量比组成。优选地，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。具体地，上述的硫酸角质素寡聚糖为硫酸角质素低聚糖混合物，即为硫酸角质素二糖、硫酸角质素三糖、硫酸角质素四糖、硫酸角质素五糖的混合物，其制备方法参考公开号为CN1174557A的中国专利“硫酸角质素寡聚糖级分及含该级分的药剂”，具体为：取硫酸角质素50g，溶解在300ml的0.1M醋酸缓冲液(pH6.0)中，加入25U内-β-N-乙酰基葡萄糖胺酶型硫酸降解酶，在37℃下降解24h。反应结束后，加入2倍体积的乙醇，搅拌，在室温下放置1夜，在4000rpm下离心15min，取上清(上清A)。往沉淀中加入300ml蒸馏水，进行溶解，加入3倍量的乙醇，搅拌，在室温下放置1夜，4000rpm下离心15min，取上清(上清B)。将上清A和上清B混合，减压浓缩，使用Bio-Gel-P-2柱(3.6╳134cm)，以蒸馏水作为溶剂，进行凝胶过滤，将滤液冷冻干燥即得。具体地，上述的壳聚糖微载体为表面含有聚羟基脂肪酸酯的壳聚糖微球，所述的聚羟基脂肪酸酯是一种胞内聚酯，具有良好的生物相容性和可降解性，其结构中的羟基、羧基可与壳聚糖在酸性溶液中质子化形成的-NH3+产生交联作用，从而使壳聚糖分子沉析出来。进一步地，所述的微载体浓度为4～6g/L，优选为5g/L，具体地，所述的壳聚糖微载体的制备包括以下步骤：取壳聚糖溶解于2％(v/v)的稀醋酸中，磁力搅拌制成浓度为10～15％(m/v)的壳聚糖溶胶液，加入1～4％(m/v)醋酸铵，搅拌均匀，加入聚羟基脂肪酸酯，超声处理25～30min，然后密封于高压蒸汽锅中，在250℃下处理3～4h，冷却至室温，离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将种子细胞BHK21进行复苏，然后接种至搅拌式生物反应器中，采用低血清培养基进行微载体悬浮培养，培养条件为：转速30～50r/min，溶氧40～60％、pH值7.2～7.3、温度36.5～37.5℃，培养至细胞的浓度为1.5～3╳10

【技术特征摘要】
1.一种微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将种子细胞BHK21进行复苏，然后接种至搅拌式生物反应器中，采用低血清培养基进行微载体悬浮培养，培养条件为：转速30～50r/min，溶氧40～60％、pH值7.2～7.3、温度36.5～37.5℃，培养至细胞的浓度为1.5～3╳107个/ml；(2)沉降微载体和细胞，以细胞维持液替换低血清培养基，进行灌流连续培养，培养条件为：转速60～80r/min，溶氧30～50％、pH值7.4～7.5、温度35～37℃，灌流速度为1～2个反应器体积/天，同时以同样的速率泵出细胞悬浮液，保证细胞在反应器中停留时间内扩增至1.5～3╳107个/ml；(3)将猪伪狂犬gE基因缺失病毒按照感染复数为0.01，接种至连续培养的BHK21细胞反应器中进行培养，培养条件为：转速40～50r/min，溶氧40～50％、pH值7.4～7.5、温度35.5～36.5℃，接毒12h后开始灌流，灌流速度为1个反应器体积/天，接毒48h后开始收获病毒液；(4)将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，即得。2.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的将种子细胞BHK21进行复苏具体为：将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6～8min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为3～5×105个/mL的细胞悬液。3.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的低血清培养基的组成为包含有1～1.5％(m/v)FBS、0.5～2％(m/v)D-氨基葡萄糖、2～4mmol/L谷氨酰胺、4～6％(m/v)生长促进剂、1.0～1.2％(v/v)双抗的DMEM培养液；所述的细胞维持液的组成为包含有4～8mmol/L谷氨酰胺、0.4～1.2mg/L二亚油酰磷脂胆碱、2～6％(m/v)D-氨基葡萄糖、2～4％(m/v)生长促进剂、1.0～1.2％(v/...

【专利技术属性】
技术研发人员：严悌昆，张毓金，黄淑芬，敖艳华，
申请(专利权)人：广东渔跃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44