一种新型t载体及其应用方法技术

将待克隆的DNA片段成功插入载体DNA，是筛选目标克隆，进而测定基因序列、分析基因结构与功能、进行基因重组表达等研究工作的首要步骤。本发明专利技术的新型载体pHsh-T具有以下特征：（1）同时具有T载体易于克隆和pHsh载体高效表达的功能；（2）具有双向基因表达元件，使正、反向连接的外源基因都得到有效表达，可用于基因文库的构建和活性筛选；（3）质粒分子小，是基因容量大、转化率高、易于进行原位基因改造的表达型T载体。用本发明专利技术的载体进行PCR产物的克隆、基因文库的构建和筛选，以及基因的超量表达，可以简化操作步骤、节约材料和时间；提高试验的准确性和成功率；加快研究进程以期获得更多科技成果。

【技术实现步骤摘要】
一种新型T载体及其应用方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及分子生物技术、微生物工程、基因工程等
中的一种新型T载体，更涉及一种高效转化、双向表达型T载体的结构、性质及应用技术。
技术介绍
将待克隆的DNA片段成功插入载体DNA，是筛选目标克隆进而测定基因序列、分析基因结构与功能、进行基因重组表达等研究工作的首要步骤。发展能够与DNA片段高效连接和闻效转化的新型载体有利于简化基因操作步骤、节省材料和时间；提闻基因克隆的准确性和成功率；加快研究进展、获得更多科技成果。DNA的末端状态和首尾匹配状况对插入片段与载体之间的连接率的影响很大。粘性末端连接要比平末端连接的效率高，人们通常选用限制性DNA内切酶对片段和载体进行切割，产生带粘性末端的插入片段和线性化载体以便连接。但是，由于这些DNA首尾粘性末端的序列互补，易发生插入片段的自相连接，以及线性载体自身的首尾连接，从而降低了连接效率。TA克隆技术采用另一种方式进行粘性末端连接:Taq DNA聚合酶扩增产生的PCR产物的双链两端各带有I个3’端悬挂的A(腺苷酸)，能够与末端带有T (胸腺核苷酸)的载体进行连接(Holto et al., 1991, Nucleic Acids Res，19:1156)。因为 TA 克隆中每一段线性DNA的两端序列不能相互配对，从而有效地避免了目标基因片段之间的相互连接或载体的自身环化。TA克隆技术已经广泛应用于PCR产物的克隆，其原理是TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能够在双链DNA的3’末端加上I个核苷酸。用Taq DNA聚合酶扩增得到的PCR产物的末端通常被`加上I个A ;为了与之互补，人们用限制性内切酶如EcoRV切割载体质粒产生平末端，再用TaqDNA聚合酶在线性质粒两端添加T，所制成的两端带有3’端悬挂T的、用于TA克隆的载体被称为T载体。目前市场上销售的T载体的应用效果不够稳定，因为T核苷酸并非TaqDNA聚合酶优先聚合的核苷酸，仅部分载体的3’端能添加上T，并且有些末端可能被加上过多的T。市售T载体的另一个欠缺是基因表达功能较弱，PCR产物克隆成功后，还需要用限制性内切酶切下目的片段，亚克隆到经同样酶切处理的表达载体中，才能进行基因的超量表达研究。因此通常T载体只能作为中间载体，后续还要进行一系列繁琐的操作。钟星等最近发表了关于构建一种用于基因克隆和表达的定向T载体pETG的研究论文(钟星等，2012，生物工程学报，29:510-519)。本文中作者对TA克隆技术作了三方面的改进:⑴通过限制性内切酶Bfu I切割产生T载体，保证载体末端序列正确；(2)以表达载体pET-23a为基础，可用于基因的表达；(3)弓丨入IacO序列鉴定PCR扩增的目标基因的正反向连接。该论文在构建自制的可用于基因表达的T载体方面，以及TA克隆的定向选择方面为基因工程工作者提供了有效的方法。但是，由于PET系统的表达载体本身的性质问题，所产生的T载体pETG在应用中表现有以下不足之处:(1)必须添加昂贵的化学诱导剂IPTG诱导基因的表达；(2)被诱导表达的许多外源基因易产生包涵体或细胞毒性，从而限制基因产物的活性或抑制转化子生长；(3)因为IacO的部分序列必须合成在引物上，定向筛选仅适用于PCR产物的克隆；(4)pET质粒分子较大，转化率相应较低，并且因基因反向插入，约有50%的转化子中的基因不能表达。大肠杆菌表达载体pHsh是本研究组专利技术的热激诱导型高效表达系统，2010年获得美国专利技术专利授权(US7，807，460B2)，相关技术在国内已经有论文综述(蒋钰瑶等，2012，微生物学通报，39:394-400)。热激载体pHsh与国际通用的pET等表达系统相比具有以下独特的优势:(I)避免添加化学诱导剂，降低成本减少污染；(2)通过激活分子伴侣的表达提高细胞生长密度和目标蛋白的可溶性；(3)pHsh是最小型的表达载体，容量大、转化率高，并且有利于对目标基因进行原位定点诱变或定向进化。但是，pHsh系统的质粒中还没有用于TA克隆的T载体，迄今还需要通过多克隆位点将外源基因克隆到pHsh载体中进行基因表达。这种方式不仅使工作繁琐，而且常常受限制性内切酶的匹配性的限制。本专利技术利用表达载体PHsh的优势，设计并构建一种兼有克隆、表达和目标基因活性筛选功能的高效T载体，pHsh-T。
技术实现思路
1.专利技术目的利用pHsh系统的表达载体的优点，构建一种具有以下特征的新型T载体:(I)同时具有T载体易于克隆和pHsh系统的高效表达的功能；(2)质粒分子小，具有基因容量大、转化率高等特点，可提高基因的转化效率；(3)具有双向基因表达元件，使正、反向连接的外源基因都得到表达，适用于基因文库的构建和基因产物的活性筛选。2.本专利技术的具体描述本专利技术载体的设计方案:表达载体pHsh-Cm是环状质粒，不具有T载体功能。为了达到本专利技术的目的，我们设计新型T载体的前体质粒。前体质粒中保留了 pHsh-Cm中的氯霉素抗性基因和Hsh启动子(Hsh pro)表达元件；修改了质粒复制元件中的I个限制性内切酶Bfu I识别位点中的碱基；切除了多克隆位点；插入了 I个与Hsh启动子方向相反、由Sigma70识别的持家基因启动子(Hkg pro)和相应的转录终止子；并且在两个双向的启动子之间加入两个背向的Bfu I识别位点。前体质粒为环状，转化大肠杆菌后在细胞中可以得到大量复制；用Bfu I酶对前体质粒进行切割后，即可获得本专利技术的T载体(图1)。实现本专利技术的操作技术:(I)选择合适的目标载体和限制性内切酶。首先，选择合适的目标载体进行改造，本专利技术选择的是本研究组构建的新型大肠杆菌高效表达载体pHsh-Cm(GenBank登录号:FJ571620)。再选择合适的限制性内切酶，所选择的限制性内切酶位点在载体上应该尽可能的稀有，更重要的是酶切以后要在线性化载体的两端各留下I个3’端悬挂的碱基T。限制性内切酶Bfu I的识别和切割位点如图3-a所示。其中，“N”为A、T、C或G任意碱基。将酶切位点的碱基设计成如图3-b所示序列,切割后可以产生3’端悬挂T的末端。因为Bfu I的识别和切割位点是非对称性的，因此，正负链上各设置一个Bfu I位点就可以产生带有两个T末端的线性化载体。(2)突变目标载体。对选定的目标载体进行定点诱变，消除目标载体上的Bfu I酶切位点。这里及以下涉及的限制性内切酶及DNA修饰酶的使用、基因克隆、大肠杆菌转化等相关操作的具体方法均按《分子克隆手册》第三版上的标准方法进行(Sambrook and Russell, 2001, CSHLPress, Cold Spring Harbor, New York)。`(3)切除多克隆位点和引入反向启动子等。利用反向PCR在诱变完成后的载体的NcoI和Xho I之间引入反向启动目的基因表达的启动子Hkg pro ;通过反向PCR在Hsh pro和Hkg pro之间引入2个Bfu I酶切位点，从而形成如下结构:Hsh pro-Bfu 1-Bfu 1-Hkg pro ;再通过反向PCR引入反向的转录终止子(Hkg term),从而获得pHsh-T的前体质粒。(4)制备新型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型表达型T载体，其基本特征在于在两个末端TA连接位点的上游各有I个强启动子及相应的基因表达元件(含转录起始位点、核糖体结合位点和下游的转录终止子)，使正向和反向插入的外源基因都能得到有效表达。2.如权利要求1所述T载体，其特征在于将pHsh系列载体构建成T载体，使pHsh表达质粒的构建不再需要限制性内切酶切割，从而基因的克隆不再受限于酶切位点的匹配性。3.如权利要求1所述T载体，其特征在于具有大肠杆菌载体系统pHsh的基本结构和高效表达功能，利用热激(...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵蔚蓝，周蓉，王洪成，
申请(专利权)人：南京仙奕基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：