一种用于检测融合基因的双链探针的制备方法及通过该方法制备的探针技术

本发明专利技术涉及一种融合基因捕获探针的制备方法及由该方法制备的探针。所述方法包括：(1)根据目标基因融合位点发生的内含子和外显子确定探针区域；(2)以探针区域为模板设计引物从基因组DNA扩增探针区域；(3)对扩增的探针区域加生物亲和素标记；(4)切胶回收加生物亲和素标记的探针区域；(5)将加生物亲和素标记的探针区域随机打断成60‑120bp的小片段探针；(6)探针定量检测。本方法优点在于适用范围广，周期短，成本低。根据本发明专利技术的方法制备的探针的优点在于随机片段化实现多重覆盖，不同区域探针自由组合，高效捕获，结果准确。

A method for preparing a double stranded probe for detecting fusion genes and a probe prepared by the method

The invention relates to a method for preparing a fusion gene capture probe and a probe prepared by the method. The method comprises the following steps: (1) according to the target gene fusion of introns and exons to determine probe region; (2) to probe area as template primers were designed to amplify the genomic DNA probe region; (3) of the amplified probe plus avidin biological marker; (4) with bio gel extraction affinity probe labeled regions; (5) add biological avidin labeled probe areas were broken into 60 120bp fragment probe; (6) probe quantitative detection. The method has the advantages of wide application range, short cycle and low cost. The advantages of the probes prepared by the method according to the invention are random fragmentation, multiple coverage, free combination of probes in different regions, efficient capture, and accurate results.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测融合基因的双链探针的制备方法及通过该方法制备的探针
本专利技术属于基因检测及分子遗传学领域，具体涉及一种用于检测融合基因的双链探针的制备方法。
技术介绍
融合基因检测对很多癌症的诊断和治疗具有重要意义，目前融合基因检测的主要方法有荧光原位杂交和实时定量聚合酶链式反应(QPCR)。荧光原位杂交是融合基因检测的金标准，优点在于准确，但对于低频率融合容易漏检，操作复杂，对操作人员要求较高，只能确定大概融合位点不能定位到位点的具体序列。QPCR检测从RNA水平检测融合基因，灵敏度高，成本低，周期短，但只能检测已知确定有融合序列的融合基因类型，不能检测未知融合类型，也不能确定融合位点序列。随着二代测序技术的不断发展，测序成本越来越低，在医学领域的应用越来越广，用于检测融合基因的探针的制备技术，有助于二代测序在融合基因检测中的应用。用于检测融合基因的探针的特点在于可以确定具体的融合位点序列，主要用于检测已知基因的已知融合基因类型，也可检测出已知基因的未知融合基因类型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种融合基因检测探针的制备方法，通过该方法可快速，低成本制备出多层覆盖，均一性好，可自由组合调整的探针，该探针可高效、准确检测融合基因。一方面，本专利技术提供一种融合基因检测探针的制备方法，其包括以下步骤：(1)根据目标基因融合位点发生的内含子和外显子确定探针区域；(2)以探针区域为模板设计引物从基因组DNA扩增探针区域；(3)对扩增的探针区域加生物亲和素标记；(4)切胶回收加生物亲和素标记的探针区域；(5)将加生物亲和素标记的探针区域随机打断成60-120bp的小片段探针；(6)探针定量检测。在一个实例中，在步骤(1)中，可根据实际情况选择单端捕获或双端捕获，其中所述单端捕获指代捕获参与融合的一个基因，而所述双端捕获指代捕获参与融合的两个基因。在另一个实例中，在步骤(1)中，针对融合位点出现频繁的区域设计探针。在另一个实例中，其中，步骤(2)中的所述探针区域可为ALKintron19-exon20。在另一个实例中，探针区域扩增片段的长度可为1k-8k。在另一个实例中，其中，步骤(3)可以包括以步骤(2)中得到的产物为模板，使用生物亲和素-dUTP，通过PCR方法，对扩增的探针区域加生物亲和素标记。在另一个实例中，在步骤(4)和(5)之间，还可以包括将加生物亲和素标记的探针区域按分子比等比例混合的步骤。在另一个实例中，在随机打断之后不再有任何筛选、扩增。另一方面，本专利技术提供一种根据上述方法制备的探针。再一方面，本专利技术提供所述探针用于检测融合基因的用途。又一方面，本专利技术提供一种检测融合基因的方法，其中，使用上述方法制备的探针进行检测。有益效果根据本专利技术的方法，可快速低成本地制备出可高效准确检测融合基因的多层覆盖，均一性好，可自由组合调整的探针。附图说明图1为根据本专利技术的方法制备探针的原理流程图。图2为根据本专利技术的方法打断后探针大小分布图。图3为经过人EML4-ALK融合基因检测试剂盒(cat:RH001，购自雅康博生物)QPCR验证为ALK阳性的商业样本，用本专利技术的方法制备的探针的检测结果序列示意图。图4为对于自制0.5％ALK阳性样本，用本专利技术的方法制备的探针的检测结果序列示意图。图5显示根据本申请的实施例制备的探针对目标区域覆盖的均一性。具体实施方式为了便于了解本专利技术，下面将本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如JosephSambrook等人所著，《分子克隆实验指南(第三版)》中所述的条件，或按制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种化学试剂，均为市售产品。实施例：用于检测ALK融合基因的液相杂交捕获探针的制备1.针对ALK基因高频融合区域(Intron19-Exon20)设计扩增引物(参考文献“Tyrosinekinasegenerearrangementsinepithelialmalignancies”,AliceT.Shaw等人，NatRevCancer,2013年11月)。表1.ALK融合基因融合位点区域2.探针区域扩增具体方法如下：PCR反应体系：底物DNA(50ng/μl)，1μl；正向引物(见上表1，10μM)，1μl；反向引物(见上表1，10μM)，1μl；MgCl2(25mM)，4μl；dNTPMixture(各2.5mM)，4μl；10xLAPCR缓冲液Ⅱ(无Mg2+)，5μl；TaKaRaLAtaq(5U/μl，购自TaKaRa)，0.5μl；H2O，33.5μl；总体积50μl。扩增条件：94℃，5分钟；(94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s)30个循环；72℃，5分钟。PCR产物进行电泳初步确定为目的条带后送样测序，测序结果显示为探针区域后，剩余PCR产物可用于下列操作：克隆到载体上作为后续探针制备模板永久保存使用，具体方法详见分子克隆试验指南(可选做)。3.探针区域加生物亲和素标记PCR反应体系：底物为步骤2中得到的PCR产物，2μl；正向引物(见上表1，10μM)，2μl；反向引物(见上表1，10μM)，2μl；MgCl2(25mM)，4μl；dATP(2.5mM)，1μl；dGTP(2.5mM)，1μl；dCTP(2.5mM)，1μl；生物亲和素标记的dUTP(1mM，购自ThermoScientificTM)，2.5μl；10xLAPCR缓冲液Ⅱ(无Mg2+)，5μl；TaKaRaLAtaq(5U/μl，购自TaKaRa)，0.5μl；H2O，29μl；总体积50μl。扩增条件：94℃，5分钟；(94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s)30个循环；72℃，5分钟。4.将加生物亲和素标记后的探针区域用切胶回收试剂盒(cat.NO.28704，QIAGEN)切胶纯化。5(可选).将生物亲和素标记的探针区域混合将纯化后带有生物亲和素标记的探针稀释到20ng/μl，共50μl。如果有多个探针区域可按分子比等比例混合，如以下表2中所示。表2.多个探针区域按分子比等比例混合由于该步骤涉及较多探针区域，以上仅通过表2列出多个探针区域可按分子比混合的示例性方法。6.生物亲和素标记的探针区域片段化通过物理打断使探针片段化。根据需要选择适宜片段长度。以60-120bp探针为例，使用打断仪(Covaris)，打断条件如以下表3中所示。表3.打断条件管50μl目标BP(峰)200最高入射功率(W)175工作系数10％CyclesperBurst200处理时间(s)15007.定量质检采用Qubit荧光计对探针进行定量，定量结果为15ng/μl左右。之后，采用安捷伦2100生物芯片分析仪或电泳检测探针长度，具体结果请参见图2。通过罗氏杂交试剂盒检测探针效果(注：本发专利技术制备的探针为双链探针，使用前95℃变性10分钟，其余操作同罗氏)。具体方法详见SeqCapEZLibrary杂交说明书(NimbleGen)。结果说明在以下表4中说明根据上述方法制备的探针的捕获效果。表4.探针捕获效果探针区域大小覆盖度数据量有效数据量平均深度25334bp100％2.57M28.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合基因检测探针的制备方法，其包括以下步骤：(1)根据目标基因融合位点发生的内含子和外显子确定探针区域；(2)以探针区域为模板设计引物从基因组DNA扩增探针区域；(3)对扩增的探针区域加生物亲和素标记；(4)切胶回收加生物亲和素标记的探针区域；(5)将加生物亲和素标记的探针区域随机打断成60‑120bp的小片段探针；(6)探针定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种融合基因检测探针的制备方法，其包括以下步骤：(1)根据目标基因融合位点发生的内含子和外显子确定探针区域；(2)以探针区域为模板设计引物从基因组DNA扩增探针区域；(3)对扩增的探针区域加生物亲和素标记；(4)切胶回收加生物亲和素标记的探针区域；(5)将加生物亲和素标记的探针区域随机打断成60-120bp的小片段探针；(6)探针定量检测。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，选择单端捕获或双端捕获，其中所述单端捕获指代捕获参与融合的一个基因，而所述双端捕获指代捕获参与融合的两个基因。3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，针对融合位点出现频繁的区域设计探针。4.根据权利要求1所述的方法，其中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘琦，张艳欧，赵金银，于闯，许立志，李杰，
申请(专利权)人：大连晶泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21