蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法技术
Detection of bee colony coccus TaqMan by fluorescent quantitative PCR
The invention belongs to the technical field of plutonius detection, discloses a plutonius TaqMan fluorescence quantitative PCR detection method, according to the M.pluton 16S rRNA gene sequence specific primers and probes, to establish methods for determining the amount of PCR bee EFB bacteria TaqMan fluorescence from standard concentration of 1 * 10
【技术实现步骤摘要】
蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法
本专利技术属于蜂房蜜蜂球菌检测
，尤其涉及一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
欧洲幼虫腐臭病(Europeanfoulbrood，EFB)是由蜂房蜜蜂球菌(Melissococcuspluton，M.pluton)引起的蜜蜂幼虫死亡的一种细菌性传染病，在蜂群迅速生长时多发，最常见的症状是蜜蜂幼虫在巢房封盖前不久死亡。M.pluton对外界不良环境的抵抗力强，能在蜂尸上存活数年，在蜂蜜里也能保持长久的毒性，在蜂群间能通过患病蜂带入传播，可引起蜂群的毁灭。但引起蜜蜂幼虫死亡也有其它疾病和原因，仅依靠临床症状诊断EFB并不可靠。目前，在实验室诊断技术方面，已有细菌涂片镜检法、扫描电子显微镜法、分离培养法、蜂巢污迹染色法、凝集试验法、酶联免疫吸附试验法和DNA杂交试验法等，上述诊断方法全部是基于病原分离培养鉴定基础之上的，由于蜂房蜜蜂球菌对培养条件要求极其苛刻，且存在与其它许多次生菌的竞争，分离培养困难，上述诊断方法很难对欧洲幼虫腐臭病做出准确诊断和推广应用。由于PCR技术在病原体检测方面的...
【技术保护点】
一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：步骤一，将M.pluton基因组DNA进行普通PCR扩增，获得大小为157bp的目的片段，PCR产物经回收、克隆、转化、普通PCR和测序鉴定后作同源性比对，与GenBank中登录序列同源性达到100％；将构建的pXT‑16S重组质粒标准品用微量紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm＝1.92，计算其浓度为1.0×10
【技术特征摘要】
1.一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：步骤一，将M.pluton基因组DNA进行普通PCR扩增，获得大小为157bp的目的片段，PCR产物经回收、克隆、转化、普通PCR和测序鉴定后作同源性比对，与GenBank中登录序列同源性达到100％；将构建的pXT-16S重组质粒标准品用微量紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm＝1.92，计算其浓度为1.0×108拷贝/μL；步骤二，应用矩阵法对荧光定量PCR的引物、探针浓度和退火温度进行优化后的反应参数为：10×PCRbuffer2.5μL，MgCl21.5μL，dNTPs2μL，上下游引物各1μL，特异性探针0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，模板DNA1μL，加灭菌ddH2O至25μL；优化后的反应条件为：92℃3min；92℃10s、60℃30s，40个循环，60℃时收集荧光信号。2.如权利要求1所述的蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述F/R上下游引物的序列为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。3.如权利要求1所述的蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述探针的序列为SEQIDNO：3。4.如权利要求1所述的蜂房蜜蜂球...
【专利技术属性】
技术研发人员：何晓杰，王科珂，苏娃，王振宝，叶尔保勒，艾山江·塔斯坦，皮志媛，陈霞，李胜，阿斯喀·夏热甫汉，叶尔兰·阿不都买金，哈森，
申请(专利权)人：伊犁职业技术学院，新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：新疆,65
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