本发明专利技术公开了一种通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞迁移的siRNA及其应用。siRNA为siRNA496或siRNA538或siRNA679。本发明专利技术方法利用siRNA沉默ARPC4基因，再采用western blotting方法、CCK‑8法、流式细胞术和Transwell检测ARPC4基因对结直肠癌细胞迁移能力的变化，siRNA能够有效下调人结直肠癌SW620细胞中ARPC4基因的表达，减弱细胞的迁移侵袭，因此，通过siRNA特异性干预ARPC4基因的表达，使得ARPC4基因成为基因治疗结直肠癌的一个新靶点。
SiRNA and its application for silencing human colorectal cancer cell migration by silencing ARPC4 gene
The present invention discloses siRNA and its application for silencing human colorectal cancer cell migration by silencing ARPC4 gene. SiRNA is siRNA496 or siRNA538 or siRNA679. The method of the invention utilizes the siRNA gene silencing of ARPC4 by Western blotting CCK method, 8 method, flow cytometry and Transwell detection of ARPC4 gene on migration of colorectal cancer cells, siRNA can inhibit expression of ARPC4 gene in human colorectal cancer cell SW620, cell migration and invasion weakened, therefore, through the expression of siRNA specific intervention of ARPC4 gene, the ARPC4 gene as a new target of gene therapy for colorectal cancer.
【技术实现步骤摘要】
通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞迁移的siRNA及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞迁移的siRNA及其应用。
技术介绍
结肠直肠癌(carcinomaofcolonandrectum)胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌，严重危胁人类的身心健康，在癌症中的发病率约为9.7％。肿瘤细胞的侵润性受肿瘤—基质相互作用的调控，在结直肠癌中，Arp2/3复合体在基质细胞附近表达，它的形成提高了基质细胞与成瘤细胞之间的运动性，进而为这两种细胞的侵润性提供更适合的环境。肌动蛋白相关蛋白2/3复合体是细胞骨架的重要组成部分，能够促进新微丝核化，广泛参与细胞形状的维持、细胞运动、胞质分裂和细胞移动等功能，ARPC4与ARPC2构成该复合体的中心，在该复合体的生物学功能上扮演重要角色。在胰腺癌，结直肠癌等多种癌细胞中异常高表达。ARPC4是arp2/3复合体的组成亚基之一，它具有控制肌动蛋白(actin)在细胞内的成核过程，与下游基因产生融合蛋白以及影响胰腺癌细胞的迁移等作用。但目前未见采用siRNA沉默SW620细胞系中的ARPC4基因来抑制其迁移的相关报道。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞迁移的siRNA及其应用，通过siRNA沉默ARPC4基因的表达，可有效抑制人结直肠癌细胞的侵袭力。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞迁移的siRNA，该siRNA为siRNA496或siRNA538或siRNA679；siRNA496Sense：5＇-GAGCAGAGAACUUCUUUAUTT-3＇(SEQIDNo:1)；siRNA496Antisense：3＇-AUAAAGAAGUUCUCUGCUCTT-5＇(SEQIDNo:2)；siRNA538Sense：5＇-GGUAUGAUAUCAGCUUUCUTT-3＇(SEQIDNo:3)；siRNA538Antisense：3＇-AGAAAGCUGAUAUCAUACCTT-5＇(SEQIDNo:4)；siRNA679Sense：5＇-GCUGAAGAGUUCCUUAAGATT-3＇(SEQIDNo:5)；siRNA679Antisense：3＇-UCUUAAGGAACUCUUCAGCTT-5＇(SEQIDNo:6)。进一步地，siRNA所作用的结直肠癌细胞系为HT-29、HCT-116、SW620或SW-1116。进一步地，结直肠癌细胞系为SW620。上述siRNA在制备抑制人结直肠癌细胞迁移药物中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术方法利用siRNA沉默ARPC4基因，再采用westernblotting方法、CCK-8法、流式细胞术和Transwell检测ARPC4基因对结直肠癌细胞迁移能力的变化，siRNA能够有效下调人结直肠癌SW620细胞中ARPC4基因的表达，减弱细胞的迁移侵袭，通过siRNA特异性干预ARPC4基因的表达，使得ARPC4基因成为基因治疗结直肠癌的一个新靶点。说明书附图图1为不同结直肠癌细胞系中ARPC4基因的表达量图谱；图2为不同siRNA转染效果对比图；图3为转染后的细胞光吸收值图谱；图4为转染后细胞的生长曲线图；图5A～D为ARPC4-siRNA538对SW620细胞周期的影响图谱；图6为实验组、对照组、空白组的穿膜细胞数量图谱；图7A为E-cadherin基因表达量图谱；图7B为vimetin基因表达量图谱；图7C为PCNA基因表达量图谱。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。实施例1、由上海吉玛制药有限公司设计合成3个siRNA序列，根据靶序列对应的cDNA起始位点命名为siRNA496、siRNA538和siRNA679，另外还设计有一条阴性对照(negativecontrol,NC)序列；siRNA496Sense：5＇-GAGCAGAGAACUUCUUUAUTT-3＇(SEQIDNo:1)；siRNA496Antisense：3＇-AUAAAGAAGUUCUCUGCUCTT-5＇(SEQIDNo:2)；siRNA538Sense：5＇-GGUAUGAUAUCAGCUUUCUTT-3＇(SEQIDNo:3)；siRNA538Antisense：3＇-AGAAAGCUGAUAUCAUACCTT-5＇(SEQIDNo:4)；siRNA679Sense：5＇-GCUGAAGAGUUCCUUAAGATT-3＇(SEQIDNo:5)；siRNA679Antisense：3＇-UCUUAAGGAACUCUUCAGCTT-5＇(SEQIDNo:6)；NCSense：5＇-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3＇(SEQIDNo:7)；NCAntisense：3＇-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5＇(SEQIDNo:8)。2、采用westernblotting实验确定ARPC4基因异常高表达细胞系，其具体过程为：将人结直肠癌细胞系HT-29、HCT-116、SW620、SW480、SW-1116以及两类病人肿瘤组织在处于对数生长期时收集提取细胞中总蛋白，采用BCA法对总蛋白进行定量，然后通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，再应用Bio-Rad公司的Quantityone软件对westernblot结果进行图像分析，比较相应蛋白条带的光密度值，结果显示ARPC4基因在几种结直肠癌细胞系中均有较高表达，但SW620细胞中相对表达水平最高(P＜0.05，p<0.05时认为差异具有统计学意义)(见图1)，因此选用人结直肠癌细胞系SW620进行后续操作。3、将培养的SW620细胞分为阴性对照组(NC)、实验组(ARPC4-siRNA)和Control组(SW620)三组，在转染前一天，分别取处于对数生长期细胞消化计数后铺入6孔板内，次日，待细胞汇合度达到80％时，采用只含DMEM的培养基培养4h，然后按照LipofetaminTM2000说明书，分别转染48h，其结果见图2；其具体过程为：(1)转染前一天，将细胞接种于500μL不含抗生素的培养基中培养，使其在转染时可生长至30～50％融合；(2)制备转染液；a、用50μLOpti-MeI低血清培养基或无血清培养基稀释步骤(1)中所述siRNA，轻轻混匀，使其浓度为66nM；b、取1μLLipofetaminTM2000加入50μLOpti-MeI培养基中，室温孵育5min；c、将步骤a和步骤b所得产物混合，轻轻混匀，室温放置20min，得转染液；(3)向每孔本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞迁移的siRNA，其特征在于，所述siRNA为siRNA496或siRNA538或siRNA679；siRNA496Sense：5＇‑GAGCAGAGAACUUCUUUAUTT‑3＇；siRNA496Antisense：3＇‑AUAAAGAAGUUCUCUGCUCTT‑5＇；siRNA538Sense：5＇‑GGUAUGAUAUCAGCUUUCUTT‑3＇；siRNA538Antisense：3＇‑AGAAAGCUGAUAUCAUACCTT‑5＇；siRNA679Sense：5＇‑GCUGAAGAGUUCCUUAAGATT‑3＇；siRNA679Antisense：3＇‑UCUUAAGGAACUCUUCAGCTT‑5＇。
【技术特征摘要】
1.一种通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞迁移的siRNA，其特征在于，所述siRNA为siRNA496或siRNA538或siRNA679；siRNA496Sense：5＇-GAGCAGAGAACUUCUUUAUTT-3＇；siRNA496Antisense：3＇-AUAAAGAAGUUCUCUGCUCTT-5＇；siRNA538Sense：5＇-GGUAUGAUAUCAGCUUUCUTT-3＇；siRNA538Antisense：3＇-AGAAAGCUGAUAUCAUACCTT-5＇；siRNA679Sense：5＇-...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨春蕾，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51
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